白英提取物的免疫调节作用研究

1、白英提取物的免疫调节作用研究 作者：谢永芳，梁亦龙，舒坤贤 ，张继承，袁帅【关键词】 白英；,免疫调节摘要：目的探讨白英提取物的免疫调节作用。方法实验设3个浓度的药物组和空白对照组，对其进行正常小鼠脾淋巴细胞转化实验、迟发型变态反应、NK细胞活性测定、抗体生成细胞的检测、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞、碳廓清实验等实验。结果各项免疫学活性测定表明白英提取物能有效地增加正常小鼠的脾淋巴细胞转化率，增强小鼠迟发型变态反应、NK 细胞活性、抗体形成细胞活性、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率，且随提取物溶液浓度增高而增强。结论 白英提取物具有一定的免疫调节作用。关键词：白英； 免疫调节Effect of

2、Solanum lyratum Thunb. Extract on Immune RegulationAbstract:ObjectiveTo investigate the immunoregulation effect of Solanum lyratum Thunb. extract. MethodsThree concentrations of Solanum lyratum Thunb. extract and a control group were divided. The Immune function of Solanum lyratum Thunb. extract was

3、 studied on normal mice through the following indices：splenic lymphocyte transformation efficiency，delayed type allergy，NK activity，antibody?Dforming cells(Arc)activity，rate of carbon clearance，and rate of peritoneal macrophage phagocytizing chicken red blood cell(CRBC).ResultsIt was found that Sola

4、num lyratum Thunb. extract increased splenic lymphocyte transformation efficiency,enhanced delayed type allergy，NK activity, AFC activity，the rate of carbon clearance,and the rate of peritoneal macrophage phagocytizing CRBC. ConclusionSolanum lyratum Thunb. extract possesses a potential effect of im

5、mune regulationKey words:Solanum lyratum Thunb.； Immune regulation 白英Solanum lyratum Thunb.系茄科植物，性味苦、辛、微寒，归肝、胆经，商品名称“白毛藤”“蜀羊泉”。具有清热解毒、祛风化痰、利湿退黄、抗癌的功能，为常用抗癌中草药。临床多用于肺癌、消化道癌、宫颈癌、绒毛膜上皮癌等多种癌症，此外还用于湿热黄疸、痢疾、肾炎、咽喉肿痛、关节炎等1。单长民等2研究发现白英脂溶性提取物具有诱导人肝肿瘤细胞BEL7404产生凋亡的作用。施文荣等3研究表明白英水提液对HL60肿瘤细胞既表现为短时间作用后的细胞杀伤，也表现为

6、药物持续作用后的增殖抑制。至今未见有关白英提取液具有提高免疫功能的报道。本文通过小鼠脾淋巴细胞转化实验、迟发型变态反应、NK细胞活性测定、抗体生成细胞的检测、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、碳廓清实验等方法对白英提取物的免疫学活性进行研究，以期为白英的开发应用积累有价值的资料。1 材料1.1 材料 白英（采于重庆南山）。以75乙醇提取后，再以乙酸乙酯萃取，获得白英脂溶性提取物。DMSO溶解后以细胞培养基稀释至适宜浓度供实验用。昆明种小鼠，1820 g，购于重庆中药研究院。1.2 仪器 CO2培养箱，紫外可见分光光度计，打孔器，酶标仪，倒置显微镜，隔水式电热恒温培养箱，电子天平，离心机等。2 方法

7、2.1 白英提取物对正常小鼠免疫功能的影响2.1.1 小鼠脾淋巴细胞转化实验昆明种小鼠24只，随机平均分成4组，每组6只，除对照组外，其他3组为提取液溶液低、中、高剂量组，浓度分别为2.5，5，10 mg/ml，每鼠均腹腔注射0.2 ml,对照组注射等量生理盐水。连续注射15 d后，引颈法处死小鼠，无菌制备脾细胞悬液，通过200目钢丝网，用Hanks液清洗后，用RPMI 1640(10 胎牛血清及20 g/ml PHA)1 ml制成脾淋巴细胞悬液(1106/m1)37 ,5% CO2培养48 h后,离心5 min，取细胞涂片,瑞氏染色。观察计数，计算出脾淋巴细胞的转化百分率。2.1.2 小鼠迟

8、发性变态反应(耳肿胀法)二硝基氟苯(DNFB)诱导。称取DNFB 50 mg,置洁净干燥小瓶中，加预先配好的丙酮麻油溶液(丙酮麻油= 11) 5 ml，密塞后胶布封口。混匀、制得DNFB 溶液(临用前配制,用250 l注射器通过瓶盖取用) 。昆明种小鼠24只，体重1820 g，随机平均分成4组，每组6只，连续灌胃至第20天，每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3 cm2 ，用50 l DNFB溶液均匀涂抹于右耳两面进行攻击。攻击24 h后，颈椎脱臼处死小鼠,每鼠用打孔器取下直径8 mm的左、右耳片称重。2.1.3 NK 细胞活性测定4 取小鼠24 只,随机分成4 组,连续灌胃30 d 后，颈椎脱臼

9、法处死，无菌取脾，以新鲜传代的YAC1细胞为靶细胞,以无菌新鲜制备的脾单细胞悬液为效应细胞。取靶细胞和效应细胞各100 l，效应细胞和靶细胞个数比为501 ,取YAC1细胞和脾效应细胞各100 l，加入96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC1细胞和培养液各100 l，YAC1细胞最大释放孔加YAC1细胞和1% NP40各100 l，上述各项均设3个复孔，于37，5 % CO2培养箱中培养4 h，离心5 min，每孔吸取上清液100 l置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 l，反应3 min，每孔加入1 mol/L 的HC 130 l，在酶标仪490 nm处测定光密度值。按

10、下式计算NK细胞自然杀伤率：自然杀伤率( %)=(样品释放平均D值-自然释放平均D值)(最大释放平均D值-自然释放平均D值)100%。2.1.4 抗体生成细胞的检测5 昆明种小鼠24只，分组如前，除对照组外，其他3组为白英提取液低、中、高剂量组，腹腔注射，剂量同前，对照组注射等量生理盐水，连续注射10 d后，取脾脏，200 目筛网过滤，用Hanks 液洗3 次,每次1 500 r/ min 离心10 min ，将细胞悬浮于5 ml RPM 1640 培养液中。将表层培养基加热溶解,45 水浴保温,与等量2倍浓度Hanks 液混合,分装小试管,每管0.5 ml ，加入50 l 10% SRBC

11、,20 l 脾细胞悬液,混匀,制片,二氧化碳培养箱中培养1 h ,加入用SA 缓冲液稀释的补体(110) ,继续培养1 h ,计数溶血空斑数。 2.1.5 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验6 昆明种小鼠24只，体重1820 g，分组如前，每只小鼠腹腔注射体积分数为20 %的鸡红细胞悬液1 ml 。间隔30 min ,颈椎脱臼处死动物,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2 ml ,转动鼠板1 min。然后吸出腹腔洗液1 ml ,平均分滴于2 片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内, 移置37恒温箱温育30 min ,生理盐水中漂洗,以除去未贴片细胞。晾干,以丙酮：甲醇(体积比为

12、11) 溶液固定, Giemsa液染色3 min ,再以蒸馏水漂洗晾干。镜检,计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞和被吞噬的鸡红细胞总数。按公式：吞噬率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数100。计算吞噬百分率和吞噬指数。2.1.6 碳廓清实验给药25 d 后,尾静脉注射3.5 倍稀释的印度墨汁(每10 g 体重0.1 ml) ，分别于第2 ，10 min 内眦取血20l ，加入到3 ml 碳酸钠溶液中，600 nm 比色。另取肝、脾称重,计算吞噬指数。2.1.7 实验数据用SPSS 9.0 for Windows 软件中的方差分析进行统计检验。3 结果见表1。小鼠脾淋巴细胞转化实验结果表

13、明白英提取液能增加正常小鼠的脾淋巴细胞转化率，且作用随白英提取液浓度增高而增强。迟发型变态反应可显示白英提取液能显著地增强正常小鼠的迟发型变态反应。小鼠NK细胞活性测定实验结果表明白英提取液能增强小鼠NK细胞活性，且随浓度增高而增强。抗体生成细胞的检测结果显示，对照组与实验组相比、实验组之间相比均有显著差异，表明白英提取液有增强小鼠抗体形成细胞活性作用，且随浓度增高而增强。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果表明提取溶液能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性，且随浓度增高而增强。碳廓清实验结果显示，对照组与实验组相比，两实验组之间相比有差异，表明提取溶液有增强小鼠碳廓清作用，且随浓度增高而增强

14、。表1 白英提取物对正常小鼠免疫功能的影响（略）P0.01,n=64 讨论白英作为民间草药，其药理价值逐渐引起重视。近年来有报道其有引起癌细胞凋亡的作用。本研究结果证实了白英提取液能影响免疫系统中的免疫细胞，增强机体非特异性的细胞免疫功能，使抗病能力增强。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验及NK细胞活性测定结果表明，实验组对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力有比较明显的提高,对NK细胞活性也有比较明显的提高。NK细胞是机体抗肿瘤、抗病毒的重要因素。抗体细胞生成数的提高也可表明白英提取液可能提高机体的体液免疫功能。通常肿瘤病人的NK细胞活性很低，这一实验结果提示用白英提取物制备成口服液对肿瘤病人的治疗十分有利，从而提示白英提取液所发挥的临床抗肿瘤、抗炎作用等的机制之一可能是通过提高机体某些免疫功能而达到的。参考文献：1 章永红.抗癌中药大全M.南京：江苏科学技术出版社，2000：159.2 单长民,胡娟娟,杜冠华. 白英提取物诱导人肝癌BEL7404细胞凋亡作用J.中国药理学与治疗学，2001，(6)3：200.3 施文荣 ,刘 艳.白英对人急性早幼粒白血病HL一60细胞生长的影响J.福建中医学院学报，2002，12（1）:36.4 Mosman T.Rapid