聚乳酸_聚乙醇酸共聚物与心肌样细胞生物相容性的研究

1、6823(1)心脏杂志(ChinHeartJ)2011，基础研究聚乳酸聚乙醇酸共聚物与心肌样细胞生物相容性的研究邢玉洁，吕安林，王利，燕学波，张荣庆(第四军医大学西京医院心血管内科，陕西西安710032)摘要MSCs)衍生的心肌样细胞的生物相容性，目的:探讨聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)与骨髓间充质干细胞(BM-为构建心肌组织工程及其进一步体内回植提供研究基础。方法:以密度梯度离心法体外分离培养SD大鼠的BM-MSCs，将培养的第3代细胞用终浓度为10mol/L的5-氮杂胞苷和0.1mol/L的血管紧张素诱导分化。将诱导后的心肌样细胞接种到PLGA材料上，用沉淀法测定细胞的黏附力和黏附率;MTT比

2、色法检测细胞的增殖并绘制增殖曲线;扫描电镜观察细胞在PLGA材料上的形态学特征及细胞与该材料的相容性。结果:心肌样细胞在PLGA支架材料上贴附、生长良好，可分泌细胞外基质，其黏附、增殖能力与单纯的细胞相比无显著统计学差异。结论:PLGA与心肌样细胞具有良好的生物相容性，可作为心肌样细胞的理想载体构建心肌组织工程。关键词:聚乳酸聚乙醇酸;心肌样细胞;骨髓间充质干细胞;生物相容性;心肌组织工程中图分类号:R31808文献标识码:A7236(2011)01-068-05文章编号:1009-Biocompatibilityofpolylacticacid-co-glycolicacidandcardi

3、omyocyte-likecellsXINGYu-jie，L An-lin，WANGLi，YANXue-bo，ZHANGRong-qing(DepartmentofCardiology，XijingHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，Shaanxi，China)likecellsweretheninoculatedintomol/LangiotensinII(AngII)inculturemediumCardiomyocyte-theporesofPLGApiecesThecelladhesionrateandtheadhes

4、ivepowerwereexaminedbyconventionalprecipitationmethodandtheproliferationbehaviorofthecellswasanalyzedbyMTTassayScanningelectronmicroscopy(SEM)wasusedtoobservethemorphologyofcardiomyocyte-likecellsRESULTS:Cardiomyocyte-likecellsattached，proliferatedandsecretedextracellularmatrixinporousPLGANoob-vious

5、significancewasobservedbetweenPLGAgroupandcell-onlygroupCONCLUSIONS:Cardio-myocyte-likecellscanadheretoPLGAandproliferate，indicatingPLGAcanbeusedasascaffoldinmyocardialtissueengineeringKeywords:polylactic-co-glycolicacid;cardiomyocyte-likecells;bonemarrowmesenchymalstemcells;biocompatibility;myocard

6、ialtissueengineering心肌细胞是高度分化的终末细胞，受损后不能再生，严重限制了缺血性心脏病和扩张型心肌病的通讯作者:吕安林，副主任医师，主要从事冠心病的介入治疗和组织工程的研究作者简介:邢玉洁，硕士生Email:lvanlinfmmueducnEmail:xyujieyahoocn治疗。近年来，心肌组织工程的诞生为病损心肌提供了修复的可能性。自体骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BM-MSCs)作为心肌组织工程的种子细胞，具有多向分化潜能，不仅获取方便对供体健康无害，而且来源充足、扩增能力心脏杂志(ChinHeartJ)2011，

7、23(1)强，不存在免疫排斥及组织配型的问题，因此，是最有前景的种子细胞。组织工程中，生物材料不仅要满足临床应用时所需的物理化学性能，还需有良好的生物相容性，以确保其临床应用的有效性和安全性，故具有细胞相容性是对组织工程材料最基本的要求。本研究中，用体外细胞培养法对BM-MSCs衍生的心肌样细胞与聚乳酸聚乙醇酸(polylactic-co-glycolicacid，PLGA)共聚物的生物相容性进行了研究，以了解PLGA共聚物对心肌样细胞的形态和生物学功能的影响，以及将其用于作为心肌组织工程支架材料的可行性。1材料和方法11材料雄性SD大鼠，体质量100g由本校实验动物中心提供。PLGA由山东省

8、济南健宝开元生物材料研究所制备并检测，平均相对分子质量为2105，片状，大小约5.0cm5.0cm0.1cm，经过超声波清洗自然干燥及60Co放射消毒。L-DMEM培养基为Hyclone公司产品。胎牛血清购自杭州四季青公司。羊抗鼠心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗体购自Santacruz公司，FITC标记的抗羊IgG购自武汉博士德公司。胰蛋白酶、5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-aza)，血管紧张素(Ang)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)及二甲亚砜(DMSO)均为Sigma公司产品。Ficoll淋巴细胞分离液(1.077g/ml)为TBD公司产品。12方法121BM-MSCs的分离和培养颈椎

9、脱臼法处死大鼠，取其四肢长骨，置750ml/L酒精中浸泡5min。无菌条件下，分离胫骨和股骨，剪除两端骨骺，用不含血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，充分混匀。将细胞悬液缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，以2000r/min离心20min。取中间云雾状有核细胞层，加入L-DMEM不完全培养液充分混匀后，以1500r/min离心10min。弃上清，加入完全培养液充分混匀后，调整细胞的密度为1109/L，接种于T-25塑料培养瓶中，于37、50ml/LCO2孵箱中饱和湿度培养。3d后首次换液，除去未贴壁的悬浮细胞，以后每3d换液1次。待细胞长到90%汇合时，用2.5g/L胰蛋白进行消化，按12的比

10、例进行传代，培养至第3代备用。122BM-MSCs向心肌样细胞的诱导分化将分离培养的第3代BM-MSCs于培养的第2天，加入5-aza(终浓度为10mol/L)和Ang(终浓度为0.1mol/L)。24h后，去除诱导培养液，更换为不含5-aza和Ang的常规培养液继续培养3周，每3d69换液1次，每日观察细胞的形态变化。123免疫荧光细胞化学检测将诱导培养3周的细胞进行爬片，40g/L的多聚甲醛固定，30ml/L过氧化氢甲醇室温孵育10min，正常山羊血清封闭，加cTnI抗体，4过夜，PBS冲洗，加FITC标记的二抗，37孵育40min，PBS冲洗，甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。124细胞黏

11、附率的沉淀法检测在24孔培养板0.1cm)12块，每块材料上滴加浓度为1.0108/L的心肌样细胞悬液1.0ml，置于孵箱中复合培养4、12、24、48h后，PBS缓慢冲洗2次，去除未黏附的细胞。加2.5g/L胰蛋白酶消化后，收集细胞，用计数板计数并计算细胞的黏附率(%)，黏附率(%)=(黏附的细胞数/总细胞数)100%。125心肌样细胞增殖的MTT比色法检测实验分为两组:PLGA组和单纯细胞组(对照组)，取24块(0.5cm0.5cm0.1cm)PLGA材料分别置于96孔培养板上预湿，每孔中置1块材料，共置24孔作为PLGA组，并将不加PLGA材料的24孔作为空白对照(单纯细胞组)。将第3代

12、BM-MSCs以1108/L接种于含PLGA材料的孔中及空白对照的孔中，每孔200l。培养1、3、5、7d后，每次各取每组的6个孔加入20lMTT(5g/L)，孵育4h后终止培养。弃孔内上清液，每孔再加入150lDMSO，混匀振荡10min使结晶物充分溶解。于波长490nm用酶免疫检测仪测定各孔吸光度(A)值，并绘制细胞增殖曲线。126PLGA材料上的心肌样细胞的观察取诱导后的心肌样细胞，并调整细胞的密度为5.0109/L，接种于24孔板的PLGA材料上，每孔1ml。常规培养7d后，取出材料，用PBS漂洗3次，依次经30g/L戊二醛固定，3001000ml/L梯度乙醇脱水、真空干燥及表面喷金处

13、理后，用扫描电镜观察心肌样细胞在PLGA材料上的形态和分布。13统计学处理采用SPSS12.0统计软件包进行统计学分析。检测结果(数据)均以s表示，组间比较采用t检验，P0.05表示差异具有统计学意义。2结果21BM-MSCs的分离培养及诱导分化原代的BM-MSCs呈圆形、折光性强。培养3d后，几乎均贴壁且绝大部分伸展，形态多样，以短梭形为主，也有三角形、多角形、扇形或星形细胞，伸出长短不一、粗7023(1)心脏杂志(ChinHeartJ)2011，细不等的胞质突起。培养57d后，细胞生长加速，逐步形成大小不一、分散的细胞集落，呈放射状向四周扩展，细胞呈漩涡状或平行排列。培养14d时，细胞集落

14、间汇合成单层(图1A)。传代后，细胞的体积较原代细胞大，呈长梭形，混有少数呈三角形aza和Ang诱导后，或多角形的细胞。加入5-细胞的形态及排列开始出现变化，细胞体积明显增大，呈较均一的长梭形，排列方向趋于一致(图1B)。24、48h与12h的附率相比差异显著(P0.01)，黏附率相比均有统计学差异(P0.05);但48h与24h的黏附率相比无统计学意义(图4)，说明心肌样细胞接种于PLGA材料上后，随着培养时间的延长黏附率逐渐上升，培养24h绝大部分细胞黏附于PLGA材料上，此后的黏附率几乎不再上升。图3图1BM-MSCs的分离培养及分化(200)PLGA支架的大体结构的光镜观察(50)A:

15、原代培养14d的BM-MSCs;B:5-aza和Ang诱导3周的细胞。22心肌样细胞的鉴定免疫荧光染色结果显示:Ang联合5-aza诱导3周的BM-MSCs表达cTnI，可见细胞质内cTnI的表达呈绿色荧光(见图2)。cTnI是心肌肌钙蛋白中具有较高特异性的亚型，是鉴定心肌源性细胞的特异性标志物，其阳性表达说明诱导分化的细胞为心肌样细胞。图4心肌样细胞在PLGA材料上培养不同时间的黏附率(%)bcP0.01;与培养12h的比较，P0.05。与培养4h比较，25心肌细胞在PLGA材料上增殖的检测MTT比色法检测结果显示，心肌样细胞在PLGA材料上，随培养时间的延长，生长增殖的速度逐渐增快。PLG

16、A材料组的细胞可保持正常的分裂增殖速度，与单纯细胞培养的对照组比较无显著差异(图5)。图2Ang与5-aza诱导3周后cTnI荧光染色(200)23光镜下PLGA支架为白色或灰色多孔的方形支架，结构疏松，呈互穿网络结构。孔间隧道状相通，孔道分布均匀，大小约在100150m之间，孔隙率为90%95%PLGA支架的形态结构和特性(图3)。24心肌样细胞黏附性能的检测心肌样细胞接12、24、48h的黏附率，种到PLGA材料上培养4、分图5心肌样细胞在PLGA上的增殖曲线(59.23.8)%、(80.0别为(42.74.5)%、24、48h与4h的黏5.0)%和(83.33.8)%。12、心脏杂志(C

17、hinHeartJ)2011，23(1)26PLGA材料上的心肌样细胞的扫描电镜观察PLGA共聚物在扫描电镜下呈多孔状，孔隙分布相对较均匀。心肌样细胞在PLGA材料表面或孔内生长，多数呈梭形或多角形，有大量的细胞基质形成，覆盖于微孔表面，细胞突起丰富并相互连接，可清楚地看到长长的细胞突起(图6)。以上表明，心肌样细胞能在PLGA材料上生长增殖，形态结构无明显变化，且呈均匀分布并向材料内部生长，与PLGA材料的生物相容性良好。图6心肌样细胞在PLGA材料上的形态与分布的扫描电镜观察(3000)3讨论心肌组织工程是指利用细胞生物学、生物材料学和工程学的原理，将具有形成心肌组织能力的种子细胞与具有良

18、好生物相容性、可降解性和一定生物力学特性的支架材料共同培养，在体内或体外构建可供移植、修复心肌损伤的心肌组织。其中，种子细胞和支架材料是构建心肌组织工程的两个重要因素。理想的“种子”细胞应该具有以下特点。易于获取、培养及扩增;没有免疫原性;可以在体内或体外分化为成熟的有功能的心肌细胞;能促进新血管生成。BM-MSCs是组织工程中非常有前景的种子细胞1。大量研究证实，BM-MSCs具有良好的多向分化潜能，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、神经细胞及心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化24，且在体外经5-aza诱导能够分化成心肌样细胞5，6。苑媛等7报道，Ang在体外可能经细胞外信号调

19、节激酶通路诱导人BM-MSCs向心肌样细胞分化。而与其他来源的心肌组织工程的种子细胞相比，BM-MSCs有着难以比拟的优势:来源于自体无免疫源性;取材损伤小，仅通过骨髓穿刺就可获得，无伦理道德问题;来源充足，可反复取材;扩增能力强;培养要求低，容易推广普及;植入体内后无致瘤性。此外，BM-MSCs还易于实现外源基因的导入和表达，为基因治疗和组织工程开创了应用前景8。因此，本实验选用了71BM-MSCs作为种子细胞，体外经5-aza和Ang诱导分化为心肌样细胞。组织工程生物替代物的研究是将组织特异性细胞在适宜的体外环境下，加入相应的诱导因子，种植于具有一定生物学特性并在人体内可逐步降解的支架材料

20、上911，经三维立体培养，形成细胞生物材料复合物并移入机体。在支架材料逐步被人体降解吸收的同时，细胞不断增殖并分泌基质，最终形成新的具有与原功能和形态相同的组织或器官，进而恢复受损器官的功能。这一过程中，支架材料的选择是器官重建的关键12。理想的组织工程支架材料应具备下列特点13:良好的生物相容性，其本身或降解产物对种子细胞和机体无毒性，不会引起炎症和免疫排斥反应。可制备成三维立体结构的支架材料，具有多孔性和高孔隙率，既有利于细胞的贴附和长入，又有利于营养成分的渗入和代谢产物的排出。具有生物可降解性。材料应是可被吸收的，在组织形成过程中逐渐分解，而不影响新生组织的结构和功能。良好的表面活性:利

21、于细胞贴附，并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境。可塑性:便于加工成所需的形状，并有一定的机械强度，植入体内后，在一定时间内仍可保持其形状，使新形成的组织具有所需的外形。其中，生物相容性是基质材料在应用前首先要解决的问题。因为良好的材料细胞作用界面是细胞黏附、增殖的基础，并通过激活细胞特异性基因的表达，维持正常细胞的表型及细胞分化14。目前，用于组织工程的支架材料有天然的及合成的高分子材料。天然的高分子材料(如珊瑚、甲壳素和胶原等)具有较好的细胞亲和性，但由于天然材料的来源以及处理方法不同，可造成材料的性能难以重现，且材料强度不足，质量和降解速率也难以控制，不能满足组织工程支架

22、材料的要求。合成的高分子材料(包括无机材料和有机高分子材料)，可通过控制制作工艺，合理调节材料的组成，使材料性能具有良好的重复性。因此，目前在组织工程研究中，应用最多的仍是人工合成的可降解的高分子材料，如聚酯类、聚酸酐和聚丁二烯酸异丙酯等。其中以聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及两者的共聚物PLGA15这类聚酯类材料的研究最为广泛，且已通过美国食品及药物管理局(FDA)认证。与PLA和PGA相比，PLGA的组织相容性更优异，且降解性能、机械性能等的调节范围大，已成为目前应用最广泛的人工合成的高分子材料，也是理想的组织工程材料之一16，17。因此，本实验中选用PLGA作为支72架材料，研究

23、了其与心肌样细胞的生物相容性。众所周知，MTT是检测细胞增殖的重要方法，其特点是可重复性好、灵敏度高、操作简便和经济、快速，已广泛应用于生物相容性评价中，来检测材料对细胞的毒性作用18。本实验的结果显示，将心肌样细胞接种于PLGA材料培养后，可保持正常的分裂增殖速度，与单纯细胞培养比较，在各个时间点均无显著差异，表明PLGA材料不仅对心肌样细胞的生长无抑制作用，而且可能由于是三维立体培养可在较长时间内维持细胞生长。总之，本实验的结果表明，PLGA不但对BM-MSCs分化的心肌样细胞的形态无明显影响，而且对其生长、增殖、分化功能也无影响。PLGA与心肌样细胞的生物相容性良好，可作为心肌组织工程载

24、体材料应用。参考文献:1VilquinJT，RossetPMesenchymalstemcellsinboneandcartilagerepair:currentstatusJRegenMed，2006，1(4):5896042TsaiRY，KittappaR，McKayRDPlasticity，niches，andtheuseofstemcellsJDevCell，2002，2(6):7077123QiMC，HuJ，ZouSJ，etalMechanicalstraininducesosteogenicdifferentiation:Cbfa1andEts-1expressioninstret

25、chedratmesen-chymalstemcellsJIntJOralMaxillofacSurg，2008，37(5):4534584FukudaKDevelopmentofregenerativecardiomyocytesfrommesen-chymalstemcellsforcardiovasculartissueengineeringJArtifOr-gans，2001，25(3):1871935郭茂娟，范英昌，徐秀梅，等5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化J中国组织工程研究与临床康复，2007，11(46):963896416ShimWS，JiangS，WongP，e

26、talExvivodifferentiationofhumanadultbonemarrowstemcellsintocardiomyocytes-likecellsJBio-chemBiophysResCommun，2004，324(2):4814887苑媛，吕安林，陈丹，等血管紧张素II诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞J心脏杂志，2006，18(3):258心脏杂志(ChinHeartJ)2011，23(1)2618TaylorSE，SmithRK，CleggPDMesenchymalstemcelltherapyinequinemusculoskeletaldisease:scie

27、ntificfactorclinicalfiction?JEquineVetJ，2007，39(2):1721809LiebE，MilzS，VogelT，etalEffectsoftransforminggrowthfactorbeta1onboneliketissueformationinthree-dimensionalcellcutureIcultureconditionandtissueformantionJTissueEng，2004，10(910):1399141310JorgensenNR，HenriksenZ，SorensenOH，etalDexamethasone，BMP-2，and1，25-dihydroxyvitaminDenhanceamoredifferentiatedosteoblastphenotype:validationofaninvitromodelforhumanbonemarrow-derivedprimaryosteoblastsJSteroids，2004，69(4):21922611GoesslerUR，BugertP，BiebackK，etalInvitroanalysisoftheexpressionofTGFbetasuperfamilymembersduringchondrogenicdiffe