茅苍术药材高效液相色谱-蒸发光散射检测指纹图谱的研究

1、茅苍术药材高效液相色谱-蒸发光散射检测指纹图谱的研究        【摘要】     目的研究茅苍术的HPLC-ELSD指纹图谱。方法高效液相色谱法，蒸发光散射检测器(ELSD)，水（0.25%乙酸）-乙腈梯度洗脱；流速0.6 ml/min；柱温30。ELSD条件：不分流；漂移管温度112.8；空气流量3.1 L/min。结果共有10个共有峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）得出了茅苍术药材的对照指纹图谱。精密度、稳定性、重复性实验中各共有峰相对保

2、留时间和相对峰面积的RSD均<3。结论 该指纹图谱方法简便、重复性好，为有效地控制茅苍术药材的内在质量提供了科学依据。     【关键词】  茅苍术 指纹图谱 高效液相色谱 蒸发光散射    苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.或北苍术Atractylodes chinensis (DC.) Koid Z.的干燥根茎1。始载于神农本草经，苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒感冒等，

3、中医临床使用历史悠久。其中尤以产于江苏茅山地区的茅苍术品质最好。茅山地区是茅苍术的道地产区。但近年来国际市场对苍术的需求量日益增加，茅苍术被掠夺性采挖，加之对茅苍术生态环境的人为破坏，造成茅苍术资源的枯竭，使其濒于灭绝2。为了保护这一珍贵资源，需对其优良品质进行分析。查阅相关文献发现对茅苍术传统意义上的活性部位挥发油的研究，未发现与道地性的直接联系，所以我们选取了茅苍术的水溶性部分进行初步的指纹图谱的研究。由于茅苍术水溶性部位含有的主要成分为无紫外吸收单萜苷类，故选用蒸发光散射检测器，获得了良好而稳定的结果。按照国家药品监督管理局2000年颁发的“中药注射剂指纹图谱技术要求”的有关规定3，对产

4、于江苏茅山地区的不同采集地点的10批茅苍术进行了HPLCELSD指纹图谱方法的建立。建立其指纹图谱是为了反映其质量情况，为建立稳定、可靠、全面的质量控制方法提供科学依据。1  材料与仪器1.1  样品本实验植物样品包括茅苍术Atractylodes. lancea (Thunb.) DC.10份，南苍术2份，北苍术、白术各1份，其编号、采摘地点及采摘时间等见表1。样品采收后洗净切小块，在55下烘干备用。1.2  对照品苍术苷A，3，4，11，14-四羟基愈创-9-烯-11-O-D-吡喃葡糖苷，纯度98，本课题组分得。1.3  试剂及仪器乙腈：HPLC级；

5、乙酸：AR级；去离子水。Agilent 1100液相色谱仪，HP Chemstation色谱工作站，Alltech ELSD 2000ES蒸发光检测器，Agilent INTERFACE 35900E 数模转换器，XWK-无油空气泵，Phenoxmenex Synergi Hydro-RP 80A柱（4.6 mm×250 mm，4 m）加C18预柱。2  方法2.1  色谱条件经方法学研究确定色谱条件，流动相A：水（含0.25%乙酸），B：乙腈。梯度洗脱程序见表2。柱温30；流速0.6 ml/min；进样量：30 l。ELSD采用不分流模式，漂移管温度112.8，

6、空气流量：3.1L/min。表1  植物样品的采集情况（略）表2  梯度洗脱程序（略）2.2  供试液制备取如上干燥植物样品，粉碎，过40目筛。精密称定2 g，置索氏提取器中，加80 ml正己烷水浴加热回流脱脂8 h。弃去正己烷液，取出样品纸包待正己烷挥发至干，再加80 ml甲醇提取8 h。将甲醇提取液减压蒸至小体积，甲醇定容至10 ml，用0.45 m微孔滤膜滤过后备用。2.3  参照物标准液制备精密称取苍术苷A，3，4，11，14-四羟基愈创-9-烯-11-O-D-吡喃葡糖苷对照品，甲醇定容配成2.94及1.00 mg/ml的原液备用。2.4

7、0; 稳定性实验取茅苍术04号样品供试液，分别在0，4，8，12，24 h检测指纹图谱。结果各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值基本一致，RSD3，供试品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱技术要求。2.5  精密度实验取茅苍术03号样品供试液，连续进样5次，检测指纹图。比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD3，符合指纹图谱的检测要求。2.6  重复性实验取茅苍术09号样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试品，检测指纹图。并分别按上述液相条件测定，对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，5份供试品溶液的RS

8、D3，符合指纹图谱的要求。2.7  样品测定精密吸取供试品溶液各30 l，注入液相色谱仪，按“2.1”中色谱条件测定，记录色谱图。以苍术苷A（S峰）的保留时间及峰面积为1，计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值。并按“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”建立茅苍术药材的指纹图谱检测标准。3  结果3.1  相对保留值指纹谱的建立采用相对保留时间标定指纹峰，记录80 min的色谱图，以图谱中苍术苷A（3号峰）为参照物（S），将各指纹峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间（设定为1）比较，其比值为各指纹峰的相对保留时间。计算10批药材指纹图谱中各指纹峰的技术参数（见

9、表3），标定茅苍术的特征指纹峰为10个（见图1）。各特征指纹峰的保留时间为：峰-1（23.432 min）；峰-2（26.383 min）；峰-3（30.468 min）；峰-4（43.478 min）；峰-5（44.682 min）；峰-6（50.365 min）；峰-7（52.176 min）；峰-8（63.336 min）；峰-9（65.065 min）；峰-10（70.435 min）。其中峰6为3，4，11，14-四羟基愈创-9-烯-11-O-D-吡喃葡糖苷。表3  茅苍术指纹图谱的技术参数（略）3.2  共有指纹峰面积的比值通过10批药材测定，以图谱中苍术苷A为

10、参照物（S），将各特征指纹峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较，其比值为特征指纹峰的相对峰面积。据“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”规定，各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。峰-4单峰面积占总峰面积百分比20，其差值20；峰-3单峰面积占总峰面积百分比10，而20，其差值25；其余单峰面积比均10，峰面积比值不做要求。符合指纹图谱的要求。3.3  非共有峰面积通过10批药材供试品的测定，统计非共有峰与总峰面积的百分比，其结果为非共有峰面积百分比7.07，符合指纹图谱研究的10的检测要求。3.4  相似度采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）对各样品色谱图的原始

11、文件（输出格式为aia）进行分析，自动匹配并以10批样品生成的对照谱图（中位数法）作为对照模版，计算各色谱图的整体相似度介于0.5640.887之间。见表4。表4  10批药材相似度（略）3.5  其它药材和茅苍术HPLC-ELSD标准指纹图谱的比较在同样条件下分别测定了产于湖北和安徽的南苍术、北苍术、白术药材的色谱图，并与茅苍术HPLC-ELSD标准指纹图谱比较相似度。结果见表5。图1  典型茅苍术HPLC-ELSD色谱图（略）4  讨论    苍术为中医常用药，临床应用历史悠久，具有健脾燥湿、祛风散寒的功效，尤以产于江苏

12、茅山地区的茅苍术品质最好，历来认为茅山是茅苍术的道地产区。对茅苍术道地性的研究集中在对其挥发油的研究。大量实验证明道地产区与非道地产区茅苍术含油量有显著性差异，且道地产区低于非道地产区，这提示我们茅苍术的道地性可能不是体现在挥发油上，而是在水溶性成分中。日本学者在对茅苍术的研究中，从其水溶性部分分得了大量的单萜苷类成分，且显示具有较好的药理活性。基于这种原因，我们对茅苍术的水溶性化学成分进行了系统的化学分离，并对其指纹图谱进行研究。实验发现，苍术水溶性部分成分多为没有紫外吸收的单萜苷类成分，采用紫外检测器在图谱中基本看不到吸收峰，故本实验选用ELSD检测器并获得了满意的结果。表5 

13、与其它药材的比较结果（略）4.1  提取条件摸索  比较了甲醇、95乙醇、50甲醇、50乙醇等对样品的提取效果，以甲醇提取的样品液出峰较多，故选定甲醇做为提取溶剂。4.2  液相条件摸索  本实验采用ELSD检测方式，ELSD检测器能检测到任何挥发性低于流动相的化合物，因此溶剂中极微量的残留成分也能检测出来，造成峰的干扰或基线不稳。在液相洗脱条件的摸索中，尝试了使用甲醇水，乙腈水两种溶剂系统。即使在使用高纯度甲醇溶剂时，谱图中仍有含量较大的杂峰，而在选用乙腈时杂峰较少，故选择乙腈水做为梯度洗脱的溶剂系统。茅苍术所含成分较复杂，给液相分离带来了很大的困难，

14、通过加入一定的缓冲溶液可以大大的改善峰形，提高分离度。对几种挥发性的缓冲溶液进行比较，选定加入0.25%的乙酸。    所采集的10批药材均为野生茅苍术药材，生长年限等因素可能会对药材的内在质量产生一定的影响，所研究的指纹图谱所表达的信息，仅代表茅苍术药材的整体情况，故而10批茅苍术药材的指纹图的相对峰面积值变异较大。    10批茅苍术药材图谱与茅苍术标准指纹图谱的相似度介于0.9650.855之间，产于湖北的南苍术与茅苍术标准指纹图谱的相似度为0.867，显示两者有较接近的化学成分组成。产于安徽的南苍术与茅苍术标准指纹图谱的相似度为0.73，明显不如产于湖北的茅苍术近，这与其它实验证明的结论相符。茅苍术在茅山地区生长具有较好的道地性优势，引种于湖北地区的茅苍术道地性优势优于其它地区。产于北京的北苍术与茅苍术标准指纹图谱的相似度为0.236，显示二者之间化学成分相差大，不能混用。白术与茅苍术标准指纹图谱的相似度为0.062，相似度最低。本实验建立的HPLC-ELSD指纹图谱为快速鉴定苍术类药材提供了依据。    本实验在中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）的辅助下，得到了茅苍术药材的H