苯酚-硫酸法定量测定桔梗多糖的研究

1、苯酚-硫酸法定量测定桔梗多糖的研究         09-09-02 11:19:00     编辑：studa20                       作者：李妍 魏建和 许旭东 师凤华 褚庆龙【摘要】  目的建立桔梗多糖含量定量测定方法，

2、为评价桔梗药材及新选育品种的质量提供方法。方法桔梗样品用水提取，经多级处理除去杂质制得桔梗精制多糖，精制多糖溶解与苯酚-硫酸试剂显色；用精制多糖测得桔梗多糖与葡萄糖的换算因子，采用苯酚-硫酸比色法测定桔梗样品中多糖的含量。结果建立了一种苯酚-硫酸法测定桔梗多糖质量分数的方法，其平均回收率为97.54% ，RSD=1.44%。对不同来源桔梗中多糖的质量分数进行测定，其范围为8.54%20.28%。结论此方法简便可行，桔梗多糖供试液在4 h内显色稳定，重复性较好，可作为桔梗多糖的测定方法。 【关键词】  桔梗多糖； 苯酚-硫酸法； 定量测定Abstract：ObjectiveAn phe

3、nol-H2SO4 colorimetry method was developed for the determination of polysaccharides in Radix platycodonis samples from different origins, in order to provide a scientific basis for a quality evaluation of breeding good Radix platycodonis.MethodsExtracted with water, removed the interference componen

4、ts during the pretreatment process, and a corrected factor was used in order to minimize the error between glucose and polysaccharides of determination, the contents of the polysaccharides in Radix platycodonis samples were determined by phenol-H2SO4 colorimetry method.ResultsAn phenol-H2SO4 colorim

5、etry method for determination of polysaccharides in Radix platycodonis samples from different origins has been established. The average recovery rate for the polysaccharides was 97.54% with 1.44% of RSD (n=6). The content range of polysaccharides in Radix platycodonis from different origins was from

6、 8.54% to 20.28%.ConclusionThis determination method is simple, practical, good reproducibile and the color of the treated samples can be stabilized within 4h.Key words：Radix platycodonis;   Polysaccharide;   Phenol-sulfuric acid colorimetry method    桔梗为桔梗科Campanu

7、laceae植物桔梗Platycodon grandiflorum A DC.的根1，是一种药食同源的食品，用途广泛。桔梗多糖是一种菊糖型多聚糖2，是桔梗食用品质的主要评价指标。现代药理学研究发现桔梗多糖还具有多种生物活性，如免疫调节、祛痰、保肝、消炎、改善胰岛素、增强机体免疫功能及抗肿瘤等，具有广阔的开发前景3，4。    本实验室于2001年启动了对桔梗的优良品种选育的系统研究，并于2004年首次发现了桔梗雄性不育种质，现已选育出不育率100%的桔梗细胞质雄性不育系、保持系、自交4代纯系，以及紫花、粉花、白花等一批纯合品系，其品质需要依据药用或食用育种目标进行

8、评价5。以往对桔梗的研究主要侧重于桔梗中的皂苷类化学成分68，而忽视了桔梗中的多糖类成分及质量控制的研究。本文首次建立了应用紫外-分光光度法测定桔梗中多糖含量的检测方法。现报道如下。1   仪器、试剂与材料1.1   仪器UV-1102紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司产品；TB-214电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；数显恒温水浴锅HH-6，国华电器有限公司产品；旋转蒸发仪R-205，BüCHI有限公司产品；台式高速离心机141，Thermo ELECTRON CORPORATION产品；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240，上

9、海精宏实验设备有限公司产品；电冰箱BCD-233，伊莱克斯公司产品。1.2   试剂苯酚，北京化学试剂公司产品；浓硫酸、无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，以上试剂均为分析纯；蛋白酶，丹麦诺维信(中国)有限公司产品。1.3  材料桔梗样品共10个：GP1BC1-12和GP1BC2-6为3代不育株系；GSNH3-M3为2代粉花自交株系，种质来源于河北；GS902-7-2为3代自交保持株系，种质来源于安徽；GS218-1，GS218-2和GS228-1为2代自交系，种质来源于山东；GS111-2为2代自交株系，种质来源于赤峰；GS173-5为2代自交株系，来源于延庆野生种质

10、；CK2为山东生产用种质9。以上各样品于2007-11初地上部分枯萎后，将其根部挖出，每个样品系内随机取3株，洗净，趁鲜刮去外皮，烘箱中60 烘干，粉碎，粉末混合均匀后，装于自封袋中，置于干燥器中保存，备用。样品均采自药用植物研究所试验基地（北京市海淀区），由魏建和研究员鉴定。2   方法与结果2.1  桔梗多糖的提取与精制 称取3种不同桔梗样品的粉末（已干燥）各l0 g，置索氏提取器中，加入石油醚(沸程6090 )100 ml，90 回流提取至无色，滤渣挥干；加80%的乙醇200 ml于90 水浴回流l h，提取2次，抽滤，挥干乙醇；滤渣加150 ml蒸馏水l0

11、0 水浴回流提取l h，过滤，滤渣重复提取两次。合并滤液冷却至室温后加入相当于桔梗质量02%的蛋白酶，55 酶解，约2 h，加热至95 恒温30 s灭酶，冷却至室温，离心，取上清液浓缩至100 ml，然后用流动的自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h，将透析液离心，除去沉淀，加无水乙醇，使乙醇体积分数达到70%，冰箱中静置过夜，离心(4 800 r/min，10min)，回收上清液，沉淀用无水乙醇，丙酮，乙醚各洗涤两次，于50 烘箱中烘干即得桔梗精制多糖。称重，计算桔梗精制多糖得率，备用。结果见表1。表1  桔梗精制多糖得率结果（略）GP代表桔梗不育系测交材料，GS代表桔梗自交系材料

12、2.2  最大吸收波长的确定 精确称取50 干燥至恒重的桔梗精制多糖20 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，按照“243”中所述方法与苯酚-硫酸试剂显色，以等量的蒸馏水作空白，紫外-可见光全波长扫描，测定桔梗精制多糖的最大吸收波长。按此方法，测定3种不同桔梗精制多糖的最大吸收波长平均值为486 nm。2.3  桔梗多糖最佳醇沉体积分数的确定 以GP1BC1-12为样品，精确称取5份桔梗粉末各3 g，按照“261”所述方法，制得桔梗多糖提取液，真空浓缩至30 ml，加入无水乙醇至乙醇的体积分数分别为40%，50%，60%，70%，80%，置于冰箱中静置

13、过夜，离心(4 800 r/min，10 min)，回收上清液，收集沉淀，将沉淀置于50 烘箱中烘干至恒重，称量。测定桔梗多糖最佳醇沉体积分数为70%。2.4   标准曲线的绘制2.4.1  标准溶液的配制精确称取105 干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1051 g，置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水并稀释至刻度，配成1.051 mg/ml的标准溶液，然后分别精确移取2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 ml标准溶液，置于100 ml容量瓶中稀释至刻度，摇匀，配成系列葡萄糖标准溶液。2.4.2  5%苯酚试液的配制称取苯酚100

14、g，加铝片0.1 g，加碳酸氢钠0.05 g，油浴中常压蒸馏，收集182的馏分，取馏出液5 g，加蒸馏水100 ml， 置于棕色瓶中备用。2.4.3   标准曲线的制备分别准确移取1 ml系列标准溶液于具塞试管中，以1 ml蒸馏水作空白。每管加入5%苯酚溶液1 ml，迅速滴加浓硫酸5 ml，立即摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热10 min，迅速冷却至室温，放置10 min后，于486 nm处测吸光度。以吸光度(A)对葡萄糖质量浓度(C)作回归处理，得回归方程A=0.970 7C+0.008 9，r=0.999 3。2.5  换算因子的测定  精确称取

15、50 干燥至恒重的桔梗（GP1BC2-6, GP1BC1-12,GSNH3-M3）精制多糖20 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得桔梗多糖贮备液，苯酚-硫酸比色法测定其吸光度，由回归方程求出此精制桔梗多糖贮备液中葡萄糖质量浓度，按下式计算换算因子：    换算因子f=W/(C×D)          式中：W为称取多糖的质量(mg)，C为精制桔梗多糖贮备液中葡萄糖质量浓度(mg/ml)，D为多糖的稀释因素(ml)。测定桔梗多糖与葡萄糖的换算因

16、子平均值为1.0307（n=6）。2.6  样品中桔梗多糖质量分数的测定2.6.1  样品溶液的制备精确称取桔梗粉末2 g，加体积分数为80%乙醇80 ml，90 水浴回流1 h，重复1次，趁热抽滤，滤渣用80%热乙醇洗涤(4 ml×2)。挥干溶剂后，滤渣连同滤纸置于烧瓶中，加30 ml蒸馏水，100 水浴回流1 h，趁热过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，离心分离(4 800 r/min，10 min)，上清液置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确移取1 ml置于100 ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。  

17、0;  09-09-02 11:19:00     编辑：studa202.6.2  样品中桔梗多糖质量分数的测定精确吸取按照“2.6.1”方法制得的样品溶液1 mL，置于具塞试管中，按照“2.4.3”所述方法测定吸光度(A)，由回归方程计算供试液中葡萄糖质量浓度(C)，按下式计算样品中桔梗多糖质量分数。    多糖质量分数(%)=C·D·fW×100%          式中：C为供试液中葡萄糖

18、浓度(mg/ml)，D为多糖的稀释因素(mL)，f为换算因子，W为供试桔梗样品的质量(mg)。2.7  重复性实验 精确称取GP1BC1-12样品6份桔梗粉末各2 g，按照“261”中方法同时制取6份样品溶液，按照“243”下的方法测定吸光度(A)，计算桔梗多糖含量，检验此测定方法的重复性，桔梗多糖平均质量分数为10.31%，相对标准偏差RSD=1.51%。28   稳定性实验精确吸取按照“261”中方法制取的GP1BC1-12样品提取液，按照“243”下的方法测定吸光度(A)，每隔1 h测定1次，连续4 h考察其稳定性，吸光度(A)平均值为0.213，相对标准偏

19、差RSD=1.98%。29   加样回收率测定精确称取GP1BC1-12样品6份桔梗粉末各1 g，加入精制桔梗多糖约100 mg，按“261”样品溶液的制备和“243”的测定方法操作，得桔梗多糖平均质量分数为10.31%，计算回收率。结果见表2。表2  桔梗多糖加样回收率测定结果（略）2.10  不同桔梗样品中多糖质量分数的比较 精确称取所采集的10种不同桔梗选育品系，各3份，按“261”项样品溶液的制备和“243”项的测定方法操作，测定吸光度(A)，从回归方程中计算供试液中葡萄糖质量浓度(C)，据式和式计算出品系中桔梗多糖的质量分数。结果见表3。表3&

20、#160; 不同桔梗选育品系多糖质量分数的测定结果（略）GP代表桔梗不育系测交材料，GS代表桔梗自交系材料，CK为对照样品；n=33   讨论    目前糖类的定量测定方法主要有,苯酚-硫酸法，地衣酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法等多种方法。苯酚-硫酸法的基本原理是利用糖类在浓硫酸作用下，水解生成糠醛或其衍生物，可与苯酚试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈橙黄色，于480490 nm处有特征吸收，其颜色深浅与糖的浓度成正比。    本文采用精制桔梗多糖测得桔梗多糖对葡萄糖的换算因子以减小测定误差，避免了用葡萄糖做为标准引起的

21、系统误差，制作标准曲线简便，而且由于组成上与待测样最接近，结果较真实。作者比较了蒽酮-硫酸与苯酚-硫酸所扫描的桔梗多糖图谱，结果表明，以苯酚-硫酸为显色剂，较以蒽酮-硫酸为显色剂稳定性和重现性好，因此最终确定选择苯酚-硫酸为显色剂。同时，作者确定桔梗多糖以苯酚-硫酸为显色剂的测定波长486 nm与经典的苯酚-硫酸法最大吸收波长480490 nm一致。    采用苯酚-硫酸法测定桔梗多糖的实验表明，此方法操作简单，供试液在4 h内显色稳定，重复性好，平均回收率高，检测下限与经典的苯酚-硫酸法相差不大，且试剂消耗少，价格便宜，一般实验室都能满足测定要求10。    不同桔梗品系多糖含量差异实验结果表明，桔梗多糖质量分数范围为8%20.28%。桔梗多糖含量测定结果表明，CK2多糖质量分数在20%以上；GS218-2，GS902-7-2，GS218-1等多糖质量分数在17%20%之间；GP1BC2-6，GP2BC4-5等多糖质量分数在14%16%之间；GP1BC1-12，GSNH3-M3等多糖质量分数在10%12%之间；GS111-2，GS228-1等多糖质量分数在8%10%之间。由此可见不同桔梗选育品系多糖含量变幅较大，品种选育成效显著。【参考文献】  1 国家药典委员会.中国药典，第部S