异源双链和单链构像多态法筛查基因突变

1、论著本课题受广东省自然科学基金(编号:960149和卫生部回国人员启动基金资助作者单位:510060广州,中山医科大学中山眼科中心暨卫生部眼科学实验室(张清炯、肖学珊、黎仕强、申煌煊、张丰生、吴开力,医学遗传学教研室(曾瑞萍异源双链和单链构像多态法筛查基因突变张清炯肖学珊黎仕强申煌煊张丰生曾瑞萍吴开力【摘要】目的比较异源双链、单链构像多态(SSCP 、异源双链2SSCP 法筛查突变的效率,寻找简便有效的基因突变筛查方法。方法应用聚合酶链反应(PCR 扩增23个已知的杂合子突变,分别以异源双链、SSCP 、异源双链2SSCP 法分析突变,对比各方法对突变的检出情况。结果23个杂合子突变中,异源双

2、链法、SSCP 法与异源双链2SSCP 法检出突变分别为22个(96%、20个(87%和23个(100%。异源双链法结果比SSCP 法结果稳定,重复性好,两种方法之间有一定互补性,异源双链2SS 2CP 法兼有两种方法的特点。结论异源双链2SSCP 法突变检出率高,经济、简便,值得在基因突变筛查中推广应用。【关键词】DNA 突变分析多态现象,单链构象核酸异源双链分子Comp arison of heteroduplex ,SSCP,and heteroduplex 2SSCP analyses in mutational screening ZhangQingjiong ,Xiao Xuesh

3、an ,Li Shiqiang ,et al 3Zhongshan Ophthalmic Center ,Sun Yat 2sen Univer sity o f Medical Sciences ,Guangzhou 510060【Abstract 】Objective T o com pare the effectiveness of heteroduplex ,SSCP and heteroduplex 2SSCP analy 2ses in mutational screening.Methods DNA sam ples with 23known heterozyg ous muta

4、tions were am plified by PCR.The PCR products were then analyzed by heteroduplex ,SSCP and heteroduplex 2SSCP analyses separately to testify the effectiveness of each method.R esults O f the 23mutations ,22were detected by heteroduplex analysis (96%,20by SSCP analysis (87%and 23by heteroduplex 2SSCP

5、 analysis (100%.Results from heteroduplex analysis are m ore stable and repeatable than those of SSCP and they may com plement each other.Heteroduplex 2SS 2CP analysis has the advantages of heteroduplex and SSCP analyses.Conclusion Heteroduplex 2SSCP analysis is sim ple ,economical and m ore effecti

6、ve than SSCP or heteroduplex analysis alone and it may be widely applied in mutational screening.【K ey w ords 】DNA mutational analysis S ingle 2stranded con formational polym orphism Nucleic acid heteroduplexes基因突变检测是遗传病病因分析与基因诊断的重要环节。基于聚合酶链反应(PCR 产物分析的微小未知基因突变筛查方法,包括SSCP 、异源双链、变性与温度梯度凝胶电泳、RNA 酶裂解、化

7、学错配裂解、直接测序等,适用于涉及少数碱基的基因突变检测1,2。这些方法中,SSCP 法3使用最广泛,而异源双链法4,5最简便,并已证实在直接检出未知微小突变方面的效率。SSCP 法须用多条件分析,且结果不稳定、重复性差,对大于200bp 片段中点突变检出的效率差,因而许多PCR 产物须酶解后分析1,2,比较繁琐又费时费钱。异源双链分析结果稳定,可分析较大片段(350bp 中的点突变1,2,6,7。我们曾对异源双链法与SSCP 法筛查突变的情况作了初步比较分析7,并创立异源双链2SSCP 法筛查基因突变8。我们分别应用异源双链、SSCP 、异源双链2SSCP 三种方法检测分布于20个DNA 片

8、段中的23个突变,并进行了比较。材料和方法一、基因组DNA 制备抽取20例已知基因突变的遗传病(先天性红、绿色觉异常和视网膜母细胞瘤患者外周静脉血,以全血溶解法制备外周血白细胞基因组DNA 。二、标准突变及PCR 扩增分布于20个DNA 片段中的23个突变见附表,其中5个突变分别分布于2种DNA 片段中,另有1个突变样品有3处碱基变异(融合基因片段。每个样品中均有正常与突变拷贝各1个,为杂合性突变。附表被检标本碱基突变性质与位置及突变检出情况编号PCR产物(bp突变性质突变位置(nt+突变检出3异源双链SSCP异源双链2SSCP1206G del40+2227A del90+3116A del

9、23+4250T del97+-+5184T del114+62435bp del103107+71435bp del5155+8294GC90+9185T ins.85+ 10212CT73+ 11182TC121-+ 12277GT153+ 13197GT99+ 14221CT99+-+ 15221G T del179180+ 16221GT102+ 17221CT64+-+ 18350CT164+ 19221C del104+ 20264CT96+ 21167CT34+ 22260AC115+ 23260CT154+CG158TA192检出阳性份数222023检出百分比(%9687100

10、注:所有PCR产物中的突变均为杂合子;+突变位置从PCR产物正链5端计;3指突变可以(+或不能(-被该方法检出,突变性质通过克隆测序得来,检测中均以正常DNA作为对照使用20对引物分别对含有23个杂合性突变的样品DNA进行PCR扩增。PCR产物长度见附表。PCR产物均经过2%3%NuSieve(FMC,US A琼脂糖凝胶电泳确认,然后直接进行突变检测分析(不必经限制性内切酶酶切。三、突变检测1.SSCP分析:PCR产物稀释24倍后与等容积2×加样缓冲液(97%甲酰胺,20mm ol/L E DT A, 0.05%溴酚蓝及二甲苯氰混合,于96变性5分钟后置于冰上冷却,然后取25l混合物

11、在6%聚丙烯酰胺凝胶于15或控制在室温下30W电泳9小时。用银染色法检测观察DNA带纹。21异源双链分析:PCR产物与等容积2×加样缓冲液(97%甲酰胺,20mm ol/L E DT A,0.05%溴酚蓝及二甲苯氰混合,然后取14l混合物在8%聚丙烯酰胺凝胶于室温下或1530W电泳89小时。用银染色法检测观察DNA带纹。3.用异源双链2SSCP法筛查基因突变:(1PCR 产物与等容积2×加样缓冲液混合,于96变性5分钟后置于冰上冷却5分钟,然后立即取14l在8%的聚丙烯酰胺凝胶于室温下30W电泳89小时。用银染色法检测观察DNA带纹。在此条件下异源双链带纹比SSCP带纹好。

12、(2根据PCR扩增的效率,PCR产物略为稀释(或不稀释后与等容积2×加样缓冲液(97%甲酰胺,20mm ol/L E DT A,0. 05%溴酚蓝及二甲苯氰混合,于96变性5分钟后置于冰上冷却5分钟,然后立即取25l在6%的聚丙烯酰胺凝胶(40cm×30cm×1mm,1×T BE,含10%甘油于15下30W电泳89小时。用银染色法检测观察DNA带纹。在此条件下SSCP带纹比异源双链带纹好。结果23个杂合性突变分布于116350bp的20个DNA片段中,异源双链法可检出22个突变(96%, SSCP可检出20个突变(87%,而异源双链2SSCP联合法可检出

13、全部23个突变(附表。从附表可以看出,突变的检出与否同碱基组成成分、突变位置无明确关系。3个未被SSCP法检出、1个未被异源双链法检出的突变中,1个为缺失突变、3个为单碱基置换。有趣的是,N o.17和N o. 18为同一外显子中同一突变,N o.17的DNA片段较短,反而其中的突变未能被SSCP法检出。3个未被SSCP法检出的突变,其所在DNA片段长度均>200 bp;而20个可被SSCP法检出的突变中,13个突变所在的DNA片段长度>200bp。仅1个分布于184bp 片段中的单碱基置换未能被异源双链法检出。3例不能被SSCP法检出的突变均可被异源双链法检出,而1例不能被异源双

14、链法检出的突变则可被SSCP 法检出。异源双链法2SSCP法具有两种方法的特点,可检出所有23个突变。在结果观察中我们发现,大部分突变虽然可同时被SSCP法和异源双链法检出,但有的SSCP带纹变异明显、有的异源双链带纹变异明显(附图,单用一种方法分析有时难以确定是否有突变,容易出现假阳性与假阴性。在我们分析的23个突变中没有一个突变出现两种带纹都不清晰或不明显的情况,982中华医学检验杂志1998年9月第21卷第5期上部为SSCP分析结果,下部为异源双链分析结果,上、下对应样品相同。第5道为一单碱基置换(表1编号10,其SS2CP带纹变异明显,而异源双链带纹变异则不明显(在银染色过程中清晰可见

15、两条紧邻带纹。第9、10道分别为单碱基置换和2bp缺失(表1编号14、15,其异源双链带纹变异明显,而SSCP带纹变异则不明显。第11道为单碱基置换(表1编号16,仅见异源双链带纹异常图1异源双链法与SSCP法检测突变的比较总有一种带纹异常比较明显。由于异源双链2SSCP 法可同时有两种方法的结果,相互补充与印证,故具有明显的优越性。如在用联合法分析红与绿色觉基因外显子5的260bp RCR产物中,红色觉基因片段(r与绿色觉基因片段(g,p之间在中部分别有10(r/g和11(r/p个碱基差异;绿色觉基因片段g 与p之间有一个碱基差别。通过异源双链2SSCP联合法分析可以明确确定来源于红与绿色觉

16、基因的不同片段。讨论SSCP法是基于单链构像多态来分离不同DNA 片断3,而异源双链是基于双链构像多态来分离不同DNA片断46。联合应用两种方法,在同一凝胶中基于不同机制来检测同一突变,理应有一定互补性和优越性,因此我们在工作中摸索建立了异源双链2SSCP法8。该法集合了异源双链和SSCP两种方法的优点,通过控制待检样品变性与复性过程、待检样品与变性剂的比例、电泳条件等,在同一电泳胶中既可观察到异源双链带纹、又可观察到SSCP 带纹,突变检出率高于单用SSCP或单用异源双链,同时也提高了突变检出结果的可靠性,而操作与SSCP分析类似(未增加试剂、设备和难度,值得在突变筛查、DNA多态分析和临床

17、基因诊断中推广应用。异源双链2SSCP法的突变检测原理:杂合性DNA样品在变性解链成单链后,既可复性形成4种双链(包括正常同源双链、突变同源双链、突变正链与正常负链之异源双链、突变负链与正常正链之异源双链、又可不复性而形成4类多种立体构像单链(突变正链、突变负链、正常正链、正常负链四类。一个杂合性DNA样品经异源双链2SSCP联合法分析后,不同单、双链DNA在凝胶电泳过程中由于其立体构像、凝胶分辨率等多种因素的影响,在双链带纹区可出现14条带,在单链带纹区可出现少至1条、多至4条以上的带纹。如果PCR产物未经极度稀释,在急剧降温条件下可同时形成SSCP和异源双链。用异源双链SSCP联合法对纯合

18、突变进行分析时,应加入等量正常PCR产物混合后变性,然后进行电泳分析。参考文献1G rom pe M.The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids.Nature G enetics,1993,5:111.2D ownton S B,S laugh RA.Diagnosis of human heritable diseases2labora2 tory approaches and outcome.Clin Chem,1995,41:785.3Orita M,Suzuki Y,Sekiya T,et al.Rapid and

19、 sensitive detection of point mutations and DNA polym orphism using polymerase chain reaction.G enom ics,1989,5:874.4Nagam ine C M,Chan K,Lau Y FC.A PCR artifact:generation of het2 eroduplexes.Am J Hum G enet,1989,45:337.5White M B,Carvalho M,Derse D,et al.Detection of single base substi2 tutions as heteroduplex polym orphisms.G enom ics,1992,12:301.6Zhang Q,M inoda K.Mutation detection and genetic counseling in retinoblastoma using heteroduplex analysis.Jpn J Ophthalm ol,1995,39: 432.7Zhang Q,M inoda K.D