桔梗总皂苷含量测定方法研究

1、桔梗总皂苷含量测定方法研究                 作者：李妍张崇禧魏建和许旭东褚庆龙【摘要】  目的建立一种香草醛-硫酸比色法测定桔梗中总皂苷含量的方法，为桔梗的质量控制提供科学依据。方法索氏提取器提取，大孔吸附树脂纯化，香草醛-硫酸比色法测定桔梗总皂苷含量。结果比色法测定的线性方程为A=0.003 4C+0.006 4，相关系数为r=0.999 7，平均加样回收率为96.97%，RSD=1.51%(n=6)。对不同来源桔梗中

2、总皂苷含量进行测定，其含量范围为1.07%3.76%。结论该法测定准确，重复性好，可用于桔梗药材中桔梗总皂苷的含量测定，便于对桔梗药材进行质量评价。 【关键词】  桔梗；总皂苷；桔梗皂苷D；比色法Abstract：ObjectiveTo develop a vanillin -H2SO4 colorimetry method for the determination of total saponins in Radix Platycodonis samples, in order to provide a scientific basis for the quality contr

3、ol of Radix Platycodonis. MethodsWith Platycodin D as standard, the total saponins in Radix platycodonis was extracted with soxhlet extractor and purified with macroporous resin column chromatography, its content was determined by vanillin -H2SO4 colorimetry method. ResultsThe calibration curve of t

4、otal saponins in Radix Platycodonis samples for this method was A=0.003 4C+0.006 4, r=0.999 7. The average recovery and RSD were 96.97% and 1.51%，respectively. The content range of total saponins in Radix platycodonis from different origins was from 1.07% to 3.76%. ConclusionThis determination metho

5、d is practical, reproducible and can be used for evaluating the quality of Radix Platycodonis samples.Key words：Radix Platycodonis;  Total saponins;  Platycodin D;  Colorimetry    桔梗(Radix Platycodonis)为桔梗科(Campanulaceae)植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC的干燥根1，是一种药食

6、同源的植物，用途广泛。桔梗性味苦、辛、平，归肺经，有宣肺、利咽、祛痰、排脓之功效，用于咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛，音哑，肺痈吐脓，疮疡脓成不溃，被广泛应用于祛痰止咳药2。桔梗中的皂苷类成分，是桔梗药用品质的主要评价指标，桔梗中含有大量的三萜皂苷，已经分离鉴别出四十多种单体皂苷，如桔梗皂苷D、桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D2、D3、桔梗皂苷E等35。现代药理学研究表明，桔梗皂苷为桔梗主要的药理活性成分6。中国药典(2005年版)采用重量法测定桔梗总皂苷含量，该方法操作繁琐，特别是其中糖类成分等杂质会对测定结果产生严重干扰，造成检测结果大大高于实际总皂苷的含量7,8。本实验以桔梗皂苷D为标准品，

7、采用香草醛-硫酸显色，比色法对桔梗总皂苷的含量进行了测定。1 仪器与材料1.1 仪器与试剂UV2550型紫外可见分光光度计(日本岛津)；TB-214型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司产品）；数显恒温水浴锅HH-6（国华电器有限公司产品）；旋转蒸发仪R-205（BüCHI有限公司产品）；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240（上海精宏实验设备有限公司产品）；SK8200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SHZ-型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；大孔树脂层析色谱柱(内径3 cm，长30 cm)。标准品桔梗皂苷D (HPLC制备纯化，纯度用归一化法计算在98%以上)；

8、AB8型大孔吸附树脂(南开大学化工厂)；其他试剂均为分析纯。1.2 材料 桔梗样品共14个：GP1BC1-12和GP1BC2-6为3代不育株系，GSNH3-M3为2代粉花自交株系，种质来源于河北；GP2BC4-10和GP2BC4-5为3代不育株系，GS902-7-2为3代自交保持株系，种质来源于安徽；GS218-1，GS218-2和GS228-1为2代自交系，种质来源于山东；GS111-2为2代自交株系，GS262-W4-W2为3代自交保持株系，种质来源于赤峰；GS173-5为2代自交株系，来源于延庆野生种质；CK2为山东生产用种质，CK1为赤峰生产用种质9。以上各样品于2007?1

9、1初地上部分枯萎后，将其根部挖出，每个样品系内随机取3株，洗净，趁鲜刮去外皮，烘箱中60 烘干，粉碎，粉末混合均匀后，装于自封袋中，置于干燥器中保存，备用。样品均采自药用植物研究所试验基地（北京市海淀区），由魏建和研究员鉴定。2 方法与结果2.1 标准品溶液的制备精密称取经60减压干燥至恒重的桔梗皂苷D 3.5 mg，加70%甲醇适量溶解，置1 ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。2.2 供试品溶液的制备取桔梗药材已干燥粉末约1.0 g，准确称定，置索氏提取器中，加入10倍量的70%甲醇后，准确称重。浸泡30 min，加热回流提取3次，2 h/次，再次称重，补加70%甲醇至回流前重

10、量。过滤，合并滤液于蒸发皿中，水浴蒸发至干，用10 ml水溶解残留物，将所得溶液缓缓通过已处理好的AB8型大孔吸附树脂柱(重量比120)，反复上样5次后，以水150 ml洗脱，弃去水液，之后再以300 ml 60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，蒸干。残留物用70%甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，定容，摇匀，即得10。2.3 测定波长的选择精密移取80 l的标准品及50 l的供试品溶液，置10 ml具塞磨口试管中，于70水浴蒸发至干，精密加入10%香草醛试液0.5 ml，60%硫酸5 ml，摇匀，于60水浴加热15 min，冰水浴中冷却3 min，随行试剂做空白，在紫外分光光度计于40070

11、0 nm波长范围全程扫描11，标准品及供试品的最大吸收波长均在472 nm，且空白对照无干扰，故选择472 nm 为测定波长。百事通2.4 标准曲线的绘制精密吸取桔梗皂苷D标准品溶液0，40，80，160，200 l,置10 ml具塞磨口试管中，于70水浴蒸发至干，精密加入10%香草醛试液0.5 ml，60%硫酸5 ml，摇匀，于60水浴加热15 min，冰水浴中冷却3 min，以同法平行处理的空白溶剂为空白，在472 nm处测定吸光度。以标准品浓度C(l/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为:A=0.003 4C+0.006 4，r=0.999 7，结果看出C在此浓度

12、系列范围内与A呈现良好的线性关系。2.5 精密度实验精密吸取标准品溶液80 l，按照“2.4”项下方法显色测定吸光度，连续测定5次，结果RSD为0.30%，说明仪器的测试性能良好。2.6 稳定性实验精密吸取供试品溶液50 l，按照“2.4”项下方法操作，按不同时间测定其吸光度变化，在放置5，10，20，30，40，50，60 min后，吸光度分别为0.214，0.214，0.214，0.215，0.216，0.215，0.217。结果表明该法在60 min内，吸光度值稳定。2.7 重复性实验称取桔梗药材已干燥粉末6份，每份1.0 g，准确称定，按照“2.2”项下操作，制备6份供试品溶液，各准确

13、移取50 l，按照“2.4”项下方法操作，测定吸光度A，计算总皂苷含量。结果平均含量为3.07%,RSD为1.17%。2.8 加样回收率实验准确称取已知含量的桔梗药材已干燥粉末6份，每份0.05 g，加入桔梗皂苷D适量，按照“2.2”项下方法制备样品溶液，各取50 l样品液，按照“2.4”项下方法显色后测定吸光度，计算回收率。结果见表1。平均加样回收率为96.97%,RSD为1.51%(n=6)。表1  加样回收率实验结果（略）2.9 不同桔梗样品中总皂苷含量测定精确称取所采集的14种不同桔梗选育品系12，各3份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，各精密移取50 l，按照“2.4

14、”项下方法显色后测定吸光度，从回归方程中计算供试品桔梗总皂苷的含量，其测定结果见表2。表2  桔梗总皂苷含量测定结果（略）3 讨论    中国药典(2005年版)采用重量法测定桔梗总皂苷含量，规定其含量不得少于6%，但是重量法操作繁琐，重复性不高，特别是其中糖类成分等杂质会对测定结果产生严重干扰，造成检测结果大大高于实际总皂苷的含量，结果误差较大。本方法采用大孔树脂纯化桔梗总皂苷，然后用比色法测定，虽然不同来源桔梗中总皂苷的含量范围为1.07%3.76%，低于药典规定，但是本实验所采集样品均为一年生植株，且测定的是较纯的桔梗总皂苷，大大地减少了杂质的干扰

15、。该方法简便，准确，且精密度高，重复性、稳定性均较好，平均回收率为96.97%，可用于对桔梗药材进行质量评价。    GP代表桔梗不育系测交材料，GS代表桔梗自交系材料，CK为对照样品;n=3    通过大孔树脂纯化得到的提取液依“2.4”项下方法显色，进行全波长扫描，得到的全波长扫描图，其最大吸收波长与标准品相差很小。同时弱极性的AB-8型大孔树脂的吸附率和解吸附率均比较理想，故AB-8型大孔吸附树脂在样品的纯化中不失为较好的选择。可见该方法可以有效的去除干扰，使测定结果更加准确。    结合文献，为简

16、便桔梗总皂苷的提取，多采用超声提取法代替回流提取法，笔者总结了超声提取法的提取条件为：用10倍量甲醇在40，100%功率下超声提取3次，30 min/次。但与加热回流提取法所得提取液同时用紫外分光光度计测定吸光值，超声法所得提取液远远低于回流法。所以笔者放弃超声提取法，选用了更为准确的加热回流提取法。【参考文献】  1国家药典委员会.中国药典,部S.北京:化学工业出版社，2005:196.2魏尚洲. 桔梗资源的综合开发利用J. 陕西科技大学学报, 2005, 23(5): 141.3Lee J Y，Hwang W I，Lim S T.Antioxidant and anticance

17、r activities of organic extracts from Platycodon grandiflorum A，De Candolle rootsJJ Ethnopharmacol，2004，93(2-3)：409.4吴碧元，孙军，蒋红芳. 桔梗提取工艺的研究J.中药材，2002，25（6）：430.5何美莲，程小卫，陈家宽，等桔梗皂苷类成分及其质量分析J中药新药与临床药理，2005，16(6)：457.6Kim YS，Kim JS，Choi SUIsolation of a new saponin and cytotoxic effect of saponins from the root of Platycodon grandiflorum on human tumor cell linesJPlanta Med，2005，71(6)：566.7石俊英，董其亭，巩丽丽，等.不同产地桔梗中总皂苷成分与质量的相关性研究J.山东中医药大学学报，2006，30（3）：2