分子生物学在获取中药有效成分方面的研究与应用

1、分子生物学在获取中药有效成分方面的研究与应用摘要：中药有效成分的提取是中药研究的一个重要任务， 一种药材经过复杂的分离提取后获得的有效成分往往十分微量。如何获得更多的有效成分是中药研究的重要内容。分子生物学技术能为此研究提供新的方法，研究人员通过寻找中药有效成分的相关功能基因，并通过基因工程的方法对其进行高效表达，大大提高了中药有效成分的得率，并降低了提取成本。 关键字：分子生物学 有效成分 中药 石斛当今，以分子生物学理论为基础，以基因工程为主导的生物技术正以其巨大的活力推动着生命各学科的发展。进入21世纪，这一高新技术，在中医药研究领域中亦开始陆续被推广应甩。综合近几年国内外的研究 成果，

2、主要有以下几个方面：1 分子生物学与中药鉴定 中药的传统鉴定方法主要依靠基源鉴定、 性状鉴定、 显微鉴定以及理化鉴定四大类方法。单纯依赖于以上传统的鉴定方法，已经不能有效防止中药的混淆代用和故意伪制的发生。基于 DNA分析的分子鉴定技术，具有特异性高、准确性高、重现性好的特点，已成为传统鉴定方法的重要补充手段为中药品质标准规范管理的国际化开创良好开端。 2 分子生物学与中药资源保护 传统的药用植物资源研究，主要采用形态分类学方法划分物种。由于此方法仅建立在个体形状描述和宏观观测的水平上，得到的结论并不完善。通过引入分子生物学方法， 分析药用植物的遗传特性以及建立遗传图谱，使植物分类和资源的研究

3、更加科学化1。肉苁蓉属名贵中药材，主要来源植物为荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉，目前野生肉苁蓉资源已仅剩几 个主产区。 通过提取样本DNA，运 用 RAPD技术对荒漠肉苁蓉野生居群和管花肉苁蓉 野生居群进行研究，利用POPGENE32版软件分析其群体的遗传多样性。结果显示，两种肉苁蓉的遗传多样性均呈低下，不利于其适应环境变化的能力。 通过分析肉苁蓉遗传多样性的差异，为如何保护肉 苁蓉提供了科学的实验遗传学依据2。3 分子生物学与中药的机理研究中药的机理研究通过应用分子生物学技术已深入到几乎是最根本的基因转录水平， 并在该水平上对中药的疗效获得了一定解释，但整体上还处于探索阶段。已有的研究主要是应用如核

4、酸分子杂交、RT -PCR技术等考察“单基因” 的技术，应用如DD -PCR、DNA阵列等研究多基因的技术的报道较少。 中药调节机体平衡的特点决定了对基因转录的影响很可能是对多基因的协同影响， 如对补肾生血方的系列研究已表明此方的功效与影响EPOR、 SCF、c-myc、Bcl- 2、GM-CSF基因表达有关。因此，应用研究多基因表达的技术考察对多基因的协同影响将是未来中药基因转录水平作用机理研究的主要方向。相信随着现有技术的不断发展和完善、新技术的出现及多种技术相结合加上疾病细胞分子水平研究的深入，复杂的中药作用机理会逐步得到阐释，中药的疗效和可能发现的新功效将从机理上获得科学依据，为中药获

5、得像西药一样的市场准人权提供有力的支撑3。： 虽然随着科学技术的进步，中药材的提取方法得到了飞速发展，一些新的提取方法如超声提取技术、超临界流体提取技术、微波辅助提取技术、半仿生提取技术等得到一定的应用，但各种方法不但有自身存在的缺点，更重要的是它们不能从根本上增加药材有效成分的含量。因此，在一味的追求更好的提取方法的同时，也应该在提高药材自身成分含量上作出相应的研究4。本文以下主要介绍该方法的研究与应用概况。该方法目前主要是利用理化因子定向诱导药材某个药用部位，如根茎、种子等， 获得稳定的药材药用部位突变体， 并运用cDNA -AFL技术对突变体表达进行分析；以Mrna - cDNA克隆法，

6、单克隆抗体等构建以获得差异表达 mRNA反义基因； 构建相应的载体，转化药材，分析转基因石斛中的成分石斛碱的变化 ， 对反义基因进行筛选，确定石斛碱功能基因； 并进行基因的全长克隆， 从而获得药材有效成分相关功能基因， 再进一步对运用基因工程方法对药材有效成分进行大规模生产打下基础。 单克隆抗体是由单个细胞(杂交瘤细胞)增殖而形成的细胞克隆所产生的完全均一的、单一特异性的抗体。因此，制作出针对中药不同成份的单克隆抗体，然后用来鉴定中药的成份或测定其含量的多少。是一种简便而又高灵敏度的、重复性好的测定方法。而且，单克隆抗体不仅可以作为测定试剂还可以制成亲和层析柱，迅速地、高特异性地从复合物中提取

7、出相应的有效成份5。 石斛为传统名贵中药材，为兰科(Orchidaceae)石斛属( Dend obium Sw)， 以新鲜或干燥的茎人药 ， 我国76种石斛属植物中有30多种作为药用，著名的有铁皮石斛、金钗石 斛、霍山石斛等， 其具有“ 滋阴养胃、清热生津、润肺止咳、明目强身”之功效，神农本草经将其列为上品，被誉为“ 中华九仙草”之首。药用石斛的有效成分主要是生物碱和多糖。现代药理研究表明， 石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集、有效减轻肝损伤等作用，对眼科疾病也有明显的治疗作用。但由于石斛对环境的要求十分严格，自然条件下 ，种子萌发率极低，生长极缓慢， 再加上过

8、度采挖及环境的恶化，药材资源日趋枯竭。为保护利用这一珍稀中药材， 增加产量，不少学者进行了石斛组织培养快速繁殖研究， 并取得了一定的进展 。但试管苗移栽成活率低， 产量低， 目前还没能应用试管苗进行大面积栽培，不能满足药材市场的需求。因此石斛药源一直处于相当 紧张状态， 亟待解决6,7. 应用现代生物技术和现代农业技术来解决才是长远之计，本文以药用石斛的分子生物学在提高其有效成分石斛碱这一方面作一介绍。 石斛碱为石斛主要药用有效成分之一 ，目前已能进行人工合成， 但人工合成成本很高。因此石斛碱相关功能基因的获得，为下一步通过基因工程大量生产石斛碱奠定基础。研究人员利用理化因子定向诱导铁皮石斛种

9、胚原球茎已经获得稳定的石斛碱缺失的突变体；运用 cDNAAFLP技术、用差异显示对突变体表达进行分析；以 mRNAcD A克隆法构建铁皮石斛差减cDNA文库；以获得的差异表达的mRNA的反义基因构建相应的载体， 转化石斛，分析转基因石斛的成分石斛碱的变化，对反义基因进行筛选 ，确定石斛碱功能基因； 并进行基闪的全长克隆，从而获得石斛碱相关功能基因这些都为有效利用、开发、保护及开拓石斛资源创造条件。 Yang H H等从石斛中分离出了色素合成基因，并得到了高效表达。Kuehnle H 等用带有植物表现NosNPrr基因和番木瓜病毒(PRV)膜蛋白(CP)基因的质粒 pGA482 G G cpP

10、RV4包被的微粒轰击石斛的原球茎进行基因转移实验。通过4次杂交得到的近2 8 0个原球茎被粒子轰击，转化与否表现在组织是否变绿。培养基为 12 MS+2 蔗糖 +( 5 0 01 0 0 )mg L硫酸卡那霉素。PCR分析表明，由2次杂交得到了13株具有卡那霉素耐受性植株带有 Nos NPrr 基因，而只有1株带有 PRVCP基因。这些结论表明用粒子轰击的方法可以实现单子叶植物石斛的转基因。此外，石斛属植物转基因组织和植物的筛选还可用荧光素酶基因做为标记。Chia等 用带有 35Sluc嵌合基因质粒包被的钨颗粒u m) 轰击石斛的原球茎，3周后，向转化组织中 加入 1 mmoL的荧光素，转化细

11、胞可通过低光视频显微镜及其辅助图像处理设备检测生物性发光辨别。将转化的组织切割下来培养生长，然后进行第2轮筛选。这样经过 3轮的生长和筛选后，表达荧光素酶的组织表明基因在该组织中转化成功。同时Southern杂交也证明荧光素酶基因已结到植物基因组，该方法也可用于其他植物基 因转化的检测。除了用粒子轰击的方法来进行石斛原球茎转基因的研究外，有关石斛的研究还涉及了农杆菌介导的转基因。利用根癌农杆菌 Agrobacterium rhizogenes 侵染宿主植物受伤部位的细胞并产生大量转化毛状根，与传统的细胞培养技术相比，转化毛状根具有生长迅速、传性状稳定及激素自养型等特点，克服了植物细胞培养中对原

12、植物激素的依赖性，是生产次尘代谢产物较理想的组织。农杆菌侵染植物的关键之一是细菌侵入性基 因诱导物的作用 ，诱导物在转化过程中可将 T DNA的加下和转运通道激活，诱导Vir区基因的活化表达。在双子叶植物中，许多天然酚性化合物如乙酰丁香酮、 香豆醇和芥子醇等都是已知的细菌侵入性基因的诱导物。但在石斛中，还没有发现这类诱导物质。Nan研究发现石斛组织培养中原球茎发育早期有大量的松柏醇产生，可诱导毒性基因的表达。如果将在暗处培养的原球茎转入光照条件下，其含量呈6倍增加。原球茎松柏醇的产量是叶的11倍，这使通过农杆菌介导法获得转基因植物，即将克隆的花色基因、主要药用成分表达基因等通过农杆菌介导法转入

13、石斛原球茎成为可能。但是农杆菌介导的转基因在石斛中并未取得成功，这个研究结果提示农杆菌对单子叶植物石斛的不敏感性可能存在着新的机制。以上主要是以利用分子生物学中常用的粒子轰击和农杆菌介导的技术与原理使石斛中控制石斛碱的基因得到高效表达，从而达到提高石斛中有效成分石斛碱含量的目的。分子生物学在基因水平下来提高药材的有效化学成分是获得优质药材的有效途径，随着技术的不断更新与进步，相信此方法在不久的将来将会得到广泛的利用。参考文献1.陈士林，苏钢强等中国中药资源可持续发展体系构建J中国中药杂志，30(15)：1141.2.崔光红，陈敏，黄璐琦等药用肉苁蓉的遗传多样性RAPD分析J中国中药杂志，200

14、4，29(8):72.3.范秀娟,郭姣，杨国柱，罗朵生. 分子生物学技术在中药作用机理研究中的应用J广东药学院学报,2007.23(5):592-595.4. 莫雪梅. 分子生物学在中药研究中的应用现状探讨J. 现代食品与药品杂志.2006.16(2):75-77.5.李杰芬.分子生物学技术在中药研究中的应用J.广州中药药大学学报。1996.13（3、4）：97-99。6.张治国,刘骅,王黎等铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究J.中草药，1992，23(8)：431.7.郭顺星,曹文芩,张集慧等.铁皮石斛人种子制作流程及发芽研究J中草药，1996 27(2)：105.8. 王金发. 细胞生物学.

15、北京：科学出版社，20039. 沈大棱,吴超群. Cell Biology （细胞生物学）. 上海：复旦大学出版社，200610. 桂建芳，易梅生. 发育生物学. 北京：科学出版社，200211. 特怀曼（R.M.Twyman）著. 王英典等译. 发育生物学. 北京：科学出版社，200612. 蒋晓林 ,刘昭阳;中医气学理论与现代分子生物学J;湖南中医杂志;2002年06期13. 雷燕;浅谈分子生物学技术在中医药研究领域中的应用J;北京中医药大学学报;1998年06期14. 王米渠,吴斌,严石林,李炜弘,高泓;从分子生物学的角度探讨中医藏象学说的内涵J;广州中医药大学学报;2002年04期15

16、. 王建云,付文,范亚刚;细胞与分子遗传学技术鉴定药材简介J;中国药事;1998年06期16. 陈苏红,王小红,王升启;中药影响细胞基因表达的研究进展J;中国中药杂志;2000年09期17. 周海钧;21世纪新药研究与开发的展望J;中国新药杂志;2000年01期18.Yang HH，Chua NHIsolation and characterization of genes involved in the pigment biosynthesis of orchids C Proceedings of 13 World Orchid Conference，199048-5019.Kuehnle AR，Cheng S，Zhang G,et al， Transformation of Dendrobium or chid using particle bombardment of protocormsJPlant Cell Repots，1992，11(9)：484-499.20.Chia TF，Giford DJ，Gou XP，et a1The firefly lucifera