DC和CIK细胞与肿瘤免疫治疗

1、DC和CIK细胞在肿瘤免疫治疗上应用易平勇湖南省肿瘤医院 内五科一、肿瘤免疫治疗的必要性肿瘤治疗面临复发与转移的重大难题，免疫治疗与化疗、手术、放疗有机结合，通过调动机体自身的抗肿瘤免疫能力，达到清除体内不同部位的微小残留病灶、防治肿瘤复发与转移的作用。1肿瘤免疫编辑·2002年Schreiber和Dunn等首次提出该学说。免疫系统和肿瘤相互作用中，免疫系统发挥了免疫监视和免疫逃逸的双重作用，肿瘤细胞经历清除、平衡和逃逸三个过程。·免疫逃逸：部分肿瘤在发展过程中经历了免疫系统的重塑，其免疫表型发生改变，使弱免疫原性肿瘤细胞得以逃逸免疫系统知别和攻击。肿瘤发生过程中的免疫编辑

2、过程2. 肿瘤细胞逃逸免疫攻击的机制·低表达MHC·肿瘤抗原改变，低或弱的免疫原性，·肿瘤细胞分泌抑制因子诱发宿主免疫抑制·阻止免疫效应细胞接触肿瘤细胞的生理屏障·专职APC功能缺陷，与抗原提呈相关基因表达下调，缺乏共刺激因子或黏附分子·T细胞对肿瘤特异抗原耐受3. 免疫治疗的策略1调动和增强机体抗肿瘤免疫活性2增强肿瘤细胞免疫原性3打破免疫系统对肿瘤的免疫耐受状态4. 免疫治疗的类型主动免疫治疗·概念：利用抗原性疫苗对要机体进行免疫接种，诱导产生特异性免疫应答或免疫耐受，达到治疗目的。·特点：见效慢，维持时间长如

3、肿瘤疫苗等。被动免疫治疗·概念：人为提供现成免疫效应物质（抗毒素、丙种球蛋白）或免疫效应细胞，直接发挥免疫效应。·这种免疫力是通过被动输入方式获得。·被动免疫后效应分子虽可立即发挥免疫效应，但不能产生记忆反应，其保护作用是短暂的。治疗性疫苗是近年建立和发展起来的免疫治疗新概念·治疗对象难治性的疾病：如：肿瘤、自身免疫病、慢性感染、移植排斥、超敏反应等。·作为一种特殊的治疗药物，相对预防性疫苗，利润率要高得多，而市场竞争也相对较少。两者概念和机理·预防性疫苗治疗性疫苗·可在健康人体中激活特异性免疫应答， 产生特异性抗体和细胞毒

4、T淋巴细胞（CTL）·获得对该病原体的免疫预防能力·但对已发病的个体却不能诱生有效的免疫应答作用：打破机体的免疫耐受，提高机体的免疫应答机理：可能是通过改善和增强对疫苗靶抗原的摄入、表达、处理、呈递和激活免疫应答，从根本上重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力。疗效：在已患病个体诱导特异性免疫应答，消除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。主要类型治疗性疫苗作为一种新兴的以治疗为目的的疫苗，在设计思路、制备手段和应用技术方面均体现多元化、多层面和与现代分子生物学及细胞学技术密切结合的特点，其复杂程度远远超出传统的预防性疫苗。·细胞疫苗：主要有肿瘤细胞和DC细胞疫苗。

5、83;蛋白质疫苗：抗原蛋白，融合蛋白，合成肽。·载体疫苗：病毒载体，细菌载体·基因疫苗：DNA疫苗，RNA疫苗，可复制型DNA疫苗二、DC疫苗·树突状细胞，Dendritic Cells（DC），是目前发现的体内最强的专职抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫反应中，能将肿瘤抗原递呈给T细胞，引发机体产生抗肿瘤的免疫应答反应。·利用DC疫苗，启动机体的主动免疫机制，激活免疫杀伤细胞，直接清除体内的肿瘤细胞，产生长期特异性抗肿瘤免疫记忆细胞，监控和清除新生肿瘤细胞，预防肿瘤复发。DC特点是抗原提呈能力最强的抗原提呈细胞高水平表达MHC-I I类分子；表达参与抗原摄取和

6、转运特殊膜受体；有效摄取和处理抗原，迁移至T细胞区；活化未致敏T细胞；抗原提呈效率高。DC来源1、髓源性DC：是指由骨髓和脐血中CD34+造血祖细胞生成的DC。2、血源性DC：从外周血单个核细胞来源，在GM-CSF和I L-4作用下可转变为DC。DC的分化1、细胞因子是调节DC成熟过程的重要因素：GM-CSF、TNF-促进DC分化；IL-1、IL-6和IL-12辅助DC成熟；DC的成熟也受其自身表达的黏附分子的影响。2、DC表面标志：CD11c+DC属于血液成熟的DC，CD11cDC为低水平表达黏附分子的非成熟DC。DC的迁移与成熟DC的成熟过程中，其捕获和处理抗原的能力逐渐降低，但提呈的能力

7、则明显增强。成熟后从非淋巴组织迁移到次级淋巴器官，从而激发T细胞应答。骨髓DC前体非淋巴组织非成熟DC上皮组织、胃肠道、生殖道和泌尿管道、气道以及实质脏器的间质具有很强的摄取、处理和加工抗原的能力，但提呈抗原能力弱细胞因子和抗原刺激下DC细胞成熟并迁移进入局部淋巴结摄取、处理和加工抗原的能力变弱，但提呈抗原能力逐渐增强 血流 分化 定居DC的分布与分类1、淋巴样组织中的DC：滤泡DC、并指状DC和胸腺DC2、非淋巴样组织DC：郎格汉斯细胞和间质细胞3、循环的DC滤泡DC ： 淋巴结浅皮质区淋巴滤泡内的重要APC，是参与再次免疫应答的重要细胞，通过其表面的FcR和C3bR结合免疫复合物，使免疫细

8、胞识别以免疫复合物形式存在的抗原。并指状DC ： 分布于淋巴组织胸腺依赖区和次级淋巴组织中的重要APC。为郎格汉斯细胞衍生而来。胸腺DC： 位于胸腺皮质/髓质交界处和髓质部分，生命周期很短，仅23周。郎格汉斯细胞 ： 位于表皮和胃肠上皮细胞。间质性DC： 主要分布在心脏、肝脏、肾脏、肺脏等实质器官间质的毛细血管附近。循环DC ：主要包括血液DC和淋巴DC。具有较强的摄取抗原能力，能在体外自发地与T细胞形成DC-T细胞蔟，激活未致敏T细胞，启动初次免疫应答。DC生物学特殊性形态上呈树突样；表达CDla、高水平MHC-I I类抗原和多种辅助分子，但缺乏CD14和非常特异性酯酶的表达；胞浆内存在特异

9、性Birbeck颗粒状结构；吞噬功能较低；可有效诱导巢居的静息已性幼稚T细胞发生增生。DC的表面标志DC表面表达某些可特异性结合病原微生物的受体，以及FcR和IgE分子等。DC生物学功能1、抗原提呈 利用受体介导的内吞作用摄取可溶性抗原；具有强大的液相吞饮功能；通过吞噬作用摄取大颗粒或微生物。2、参与T细胞发育、分化和激活、DC作为重要的胸腺间质细胞，对T细胞在胸腺中的选择过程起重要作用。DC对外周T细胞的分化出发挥重要作用。提供T细胞激活的协同刺激信号。3、参与B细胞发育、分化及激活促进生发中心对抗原发生特异性反应；与B细胞膜表面高亲和力Ig的表达和V基因的重排有关；DC高表达FcR、CR，

10、使其膜表面可长时间附着一定量的抗原，通过长时间刺激记忆B细胞，使其保持免疫记忆；促进静止的B细胞表达B7分子，使其具有抗原提呈功能；通过释放可溶性因子直接调节B细胞的生长与分化；可增强细胞因子直接调节B细胞的生长与分化；人外周血DC表达类似CD40L的分子，参与B细胞的激活。4、免疫调节作用 DC可分泌多种细胞因子参与免疫功能的调节；分泌多种趋化因子，介导其他免疫细胞的趋化作用。5、免疫监视功能 某些前体DC对局部各种化学信号十分敏感，在体内发挥免疫监视作用。DC参与抗肿瘤的分子机制1、DC高表达MHC、I、I I类分子，提呈大量肿瘤抗原肽，使相应T细胞的TCR被充分占据，同时DC提供高水平的

11、B7-1、B7-2、CD40共刺激因子，使T细胞充分激活。2、DC与T细胞结合后，分泌大量IL-12，主导了TH1应答，利于肿瘤的清除。3、DC还可分泌趋化因子，专一性趋化初始型T细胞，促进T细胞富集，增强对T细胞激活。DC疫苗的种类治疗程序申请填知情同意书手术留取标本免疫动员分血制备DC回输体内DC表型检测（一）、DC工艺流程-31天 胃癌患者rhIL-2，20万U肌注，1次/日0天 PBMC采集与分离 2×106/ml，无血清培基，2h，375%CO2保留贴壁细胞，添加rhIL-4及GM-CSF，各1000U/ml3天 半量换液6天 换液+TNF，10ng/ml8天 +自体肿瘤抗

12、原25ug/ml，4h后收获DC（二）DC终产品的质量控制1 细胞治疗用量，5×106/次。2 显微镜下观察DC形态正常。3 活细胞大于95%方可回输。4 纯度鉴定：HLA-DR90%。5 生物学活性鉴定：CD8680%。6 细菌、真菌及支原体培养阴性。7 热源检测阴性。DC的临床疗效CT显示：一个转移性髓性甲状腺癌DC疫苗前（左）和DC疫苗治疗后13个月（右）。显示肝转移完全消退。（上）肺损害明显减少（下），箭头所示疫苗之前的损伤部位。·延长生存期：例如转移性前列腺患者中，接受DC疫苗治疗组三年存活病人数量比未接受组高出22%，（J.clinicaloncology. 2

13、005: 23. 4500）·用DC联合化疗的急性白血病人五年生存期组为73.4%，单纯化疗组为40.3%，（中华内科杂志，2005：，44（3）；198）。·转移性肾癌：197人（14个临床试验总结），37%临床反应，4-CR，8-PR，61-DS，（EurUrol.2006.jul:50(1):11-3。三、细胞过继免疫治疗·为了克服患者体内各种免疫耐受因素，取病人少量单个核细胞，在体外待定条件下制备出大量具有杀伤肿瘤作用的免疫活性细胞，回输体内后直接发挥有效清除肿瘤的作用。适用于各种肿瘤患者。·人体内T淋巴细胞包括许多针对不同抗原的特异性细胞，经过

14、体外扩增培养，能产生对不同的肿瘤抗原具有广泛识别和杀伤效果的细胞。LAK细胞：1985年Rosenberge首次报道LAK（lymphokine activated killer）和IL-2联合静注治疗25例常规疗法治疗无效的晚期肿瘤病人，11例治疗有效肿瘤明显缩小，其中一例黑色素瘤完全缓解。肿瘤浸润性淋巴细胞（T I L）：其杀伤效率高于LAK，临床取得同样疗效，代价昂贵。这表明免疫疗法在肿瘤的治疗中可以获得疗效是不容否认的，并且与常规疗法有互补性。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine inducied killer,CIK）：1991年美国Stanford大学医学院骨髓移植研究中，Sc

15、hmidt Wolf等报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的细胞因子激活的杀伤(CIK)细胞，经不断完善，目前在肿瘤患者骨髓净化、自血病的治疗中肯定疗效，·对部分实体瘤患者的临床试验也得到今人鼓舞的效果。CIK·外周血单个核细胞在体外经IFN-、IL-la、IL-2和抗CD3单抗等刺激、扩增培养产生的杀伤细胞。·是一类非主要组织相容性复合物（MHC）和非T细胞受体（TCR）限制性的免疫活性细胞，其主要效应细胞的表面标志CD3+CD8+和CD3+CD56+，主要功能成分，NKT细、CD8+T细胞、CD4+T细胞。体外增殖能力和体内清除肿瘤的作用比LAK强。CIK制备一、

16、仪器及材料：Cobe Spectra Apheresis System采用机（Cobe BCT）及一次性血液分离装置用管道，一次性静脉穿刺针，灭菌生理盐水，淋巴细胞分离液，IL-2、IL-la、anti-CD3McAb,ALM-V无血清培基，Baxter培养袋，庆大霉素，细菌、真菌培养瓶等。CIK制备采集周围血50ml或血液分离机分离5×1081×109PBMG0DFicoll分离，回收PBMC细胞接种数2×106ml，IFN-r1000u/ml1DIL-2，IL-1a、anti-CD3McAb各1000U/ml扩增培养，IL-2浓度1000U/ml2D流氏细胞仪

17、鉴定细胞表型CD-3-8，测定56，微生物检测质控标准1 细胞总数：回输细胞8×109。2 细胞形态分类：回输细胞良好，淋巴细胞90%。3 活细胞比例：应95%。4 免疫荧光染色：CD3 +85%，CD8+60%，显示活化良好。5 回输前细菌、真菌、支原体培养应阴性。CIK细胞治疗作用1、直接杀伤，CIK细胞通过粘附因子LAF/ICAM-1途径与肿瘤细胞相互结合后，大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外，这些颗粒直接破坏瘤细胞。2、分泌多种细胞因子IFNr、TNFa、IL2和 IL-6，直接抑制肿瘤细胞生长，并通过调节肿瘤细胞对CIK的敏感性和调节免疫系统间接杀伤瘤细胞。3、CIK细胞

18、表达Fasl，可诱导肿瘤细胞凋亡，同时CIK细胞有抗凋亡基因表达，因此在体内能抵抗Fasl，阳性肿瘤细胞对CIK的反作用，故CIK能对肿瘤细胞持久的发挥溶瘤作用。CIK细胞在体内的有效期·大多数执行杀伤功能的细胞在回输后立即执行其功能，半衰期约2周至一个月。回输的细胞中包括一部分记忆细胞，可存活几年至几十年，当遇到相应刺激后，迅速在体内活化，杀伤靶细胞。CIK细胞的临床应用1 清除残存肿瘤细胞，预防肿瘤复了转移手术后无肿瘤负荷的病人。2 控制肿瘤生长，改善生活质量体内有无法进行手术治疗的肿瘤放化疗间期配合放化疗进行内科病人，不能进行其它治疗，肿瘤负荷较大恶性胸腹水中直接注射。配合放化

19、疗治疗方案·每次化疗药物使用结束后7-10天回输（淋巴细胞计数最低时）·回输后2周才能进行下一次化疗·全部化疗疗程结束后7天起，每周一次回输，至少6次适应症·白血病、肝癌、脑肿瘤、肺癌、结直肠癌、淋巴瘤等多种肿瘤。·理论上讲，由于抗肿瘤免疫可识别各种类型肿瘤的抗原，几乎所有恶性肿瘤均可成为CIK细胞治疗的对象。禁忌症T细胞淋巴瘤骨髓瘤器官移植后，长期使用免疫抑制药物的病人正在使用免疫抑制药物的自身免疫病病人回输前病人的状态·心肺肝肾功能正常·血象基本正常，无感染（或感染已被控制）·病人回输后两周内不进行化疗或全身性

20、放疗·病人没有进行免疫抑制药物治疗回输日期的确定·采用至回输，一般需要14天的细胞激活、培养、扩增时间。但由于个体差异，不同病人淋巴细胞对培养体系的反应程度不同，有时可能会延长培养时间至20天。可能会出现的副作用·回输的CIK是患者自身的淋巴细胞，因此没有免疫排斥反应。·淋巴细胞的一般在体内处于不活化的休眠状态。本疗法将淋巴细胞在体外刺激活化后回输。病人有时发热37-38度。这是短时间自限性症状。可不处理或使用解热剂对症处理。·有病人会发生输液反应。疗效观察1、清除残余肿瘤细胞，无病生存期延长2、肿瘤病灶缩小、肿大淋巴结恢复正常3、瘤标志物下降

21、、胸腹水减少或消失4、病情稳定，病人生命延长 5、临床获益，病人生活质量改善原发性肝癌临床治疗试验复发类型免疫治疗组（n=76）对照组(n=74)相关危险性(95%Cl)P*全面复发45（59%）57（77%）0.59(0.40-0.38)0.01平期复发25（33%）40（54%）0.49(0.30-0.80)0.005局部复发2（3%）5（7%）0.31(0.06-1.62)0.17大量复发11（14%）19%（26%）0.44(0.21-0.93)0.03远端转移4（5%）6（8%）0.49(0.14-1.75)0.27多中心肿瘤3（4%）7（9%）0.37(0.09-1.45)0.15

22、免疫治疗可提高患者无复发存活率CIK细胞对多种中晚期恶性肿瘤临床疗效·256患者，-期患者占17.6%，-期患者占82.4%，·男119，女137，年龄1983，4060 64.45%。病程最短7天，最长3年。·乳腺癌67例，肺癌56，肠癌37，胃癌28，淋巴瘤20肾癌、恶性黑色素瘤、食官癌、肝癌、脑瘤、卵巢癌等48例。·接受4疗程1例，3，17例，2，30例，余者1个疗程。治疗后生存期情况时间（年）随访例数存活例数生存率（%）109256246962962562389232825622688辽宁医学杂志2003年第17卷第4期治疗后肿瘤变化情况总例数CR PR MR SD PD总缓解率（%）·256 0 10 197 46 3 80.86·临床症状治疗前、后有明显改善，p0.001，·生存质量卡氏评分提高率为88.28%；体重多数有增加。·治疗前后T淋巴细胞rDNA转