实验五微生物培养基配制与灭菌

1、1.提供营养和条件2.防止污染一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的

2、环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐2.2.特殊营养：特殊营养：维生素、生长因子等维生素、生长因子等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧气的需求：、氧气的需求：细菌：6.5-7.5； 放线菌：7.5-8.5； 真菌：5.0-6.0。4.4.种类：种类：固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂分离分离 鉴定鉴定工业工业 生产生产化学成分：化学成分：物理性质：物理性质：天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基微生物培养基的微生物培养基的配制与灭菌配制与灭菌目目 的的 要

3、要 求求1.1.明确培养基的配制原理和方法，掌握其配制的明确培养基的配制原理和方法，掌握其配制的一般方法和步骤。一般方法和步骤。2.2.了解几种灭菌方法，掌握了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法干热灭菌法和和加压蒸加压蒸汽灭菌法汽灭菌法的原理及其使用方法。的原理及其使用方法。3.3.熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。（预习）作方法。（预习）培养基配制原则培养基配制原则目的明确：目的明确：营养全面、浓度适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当适宜的适宜的pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、

4、培养目的选择原料选择原料自养型：自养型： 不加碳源不加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生产生产科研科研培养基的配制方法和步骤培养基的配制方法和步骤称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，溶解。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，溶解。调调pHpH值：用值：用1N NaOH1N NaOH或或1N HCl1N HCl调调pHpH，用，用pHpH试纸对照。试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水

5、。过滤过滤分装分装包扎，挂上标签（灭菌指示条），注明何种培养基和配制时间。包扎，挂上标签（灭菌指示条），注明何种培养基和配制时间。灭菌：灭菌：1211210 0C 20minC 20min倒置平板倒置平板检查：培养基灭菌后必须在检查：培养基灭菌后必须在37370 0C C下恒温培养下恒温培养24h24h，确定无菌生长，方，确定无菌生长，方可使用。可使用。按培养基按培养基配方称量配方称量加水加加水加热熔化热熔化调节调节pH值值过滤过滤分装分装包装包装灭菌灭菌检查灭菌检查灭菌彻底与否彻底与否培养基的配制和灭菌过程中的注意事项培养基的配制和灭菌过程中的注意事项1.1.蛋白胨很易吸湿，在称取时蛋白胨很

6、易吸湿，在称取时动作要迅速动作要迅速。l3.在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，腾而溢出容器。同时，需不断搅拌需不断搅拌，以防琼脂糊底烧，以防琼脂糊底烧焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。离子进入培养基中，影响细菌生长。l4.pH不要调过头不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。浓度。l5.分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免以免引起污染。引

7、起污染。l2.称药品时称药品时严防药品混杂严防药品混杂，一把牛交匙用于一种药品，一把牛交匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。瓶盖也不要盖错。培养基培养基、玻璃器皿、玻璃器皿天平秤、天平秤、药药匙匙 以量桶量桶装取适当量蒸蒸馏馏水水于玻璃容器中 于玻璃容器上标示培养基名称 放上秤药纸并归零归零 以秤药匙舀出适当量培养基 (请看培养基罐上说明)倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上 清理配药桌面与天平 清洗秤药匙，擦干放回 药品放回药品柜 调整分注器分注器 (Dispensette) 刻度 分装试管 盖上试管盖6.6

8、.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。l不能灭菌的物质：不能灭菌的物质： 1.爆炸性物质爆炸性物质l硝化丙烷硝化丙烷 、硝化甘油、硝化纤维，含氮硅酯。、硝化甘油、硝化纤维，含氮硅酯。 三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮

9、复合物。复合物。l过醋酸过醋酸 、过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酰和其它过氧化、过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酰和其它过氧化有机物。有机物。 2.lgnitable 物质物质l金属锂、钾、钠、黄磷、氧化硫，和红磷。金属锂、钾、钠、黄磷、氧化硫，和红磷。培养基的配制和灭菌过程中的注意事项培养基的配制和灭菌过程中的注意事项实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基； 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培

10、养基: :用于分离和培养细菌用于分离和培养细菌的基础培养基的基础培养基，又称天然培养基。，又称天然培养基。 配方如下：配方如下： 牛肉膏牛肉膏 3 g 蛋白胨蛋白胨 10 g 氯化钠氯化钠 5 g 琼脂琼脂 20 g 自来水自来水 1000 mL pH 7.27.4 淀粉琼脂培养基淀粉琼脂培养基（高氏一号高氏一号），），用于分离和培用于分离和培养放线菌养放线菌，是一种合成培养基。，是一种合成培养基。 配方如下：配方如下： 可溶性淀粉可溶性淀粉 20.0 g KNO3 1.0 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 7H2O 0.5 g NaCl 0.5 g FeSO4 7H2O 0.01 g

11、 琼脂琼脂 20 g 自来水自来水 1000 mL pH 7.47.6 查氏培养基查氏培养基，用于分离和培养霉菌用于分离和培养霉菌，是一种合成培养基。，是一种合成培养基。 配方如下：配方如下： NaNO3 2.0 g K2HPO4 1.0 g KCl 0.5 g MgSO4 0.5 g FeSO4 0.01 g 蔗糖蔗糖 30g 琼脂琼脂 20 g 自来水自来水 1000 mL pH 自然自然LB(Luria-Bertani)培养基培养基1000mlLB1000mlLB培养基的配方培养基的配方HH2 2O O 定容至定容至1000mL1000mL胰蛋白胨胰蛋白胨 (Tryptone) 10g(

12、Tryptone) 10g氯化钠（氯化钠（NaClNaCl） 10g10g琼脂（琼脂（agaragar） 15g15g酵母提取物酵母提取物(Yeastextract) 5g(Yeastextract) 5g20g20gYPD培养基培养基 for yeastfor yeast1000ml1000mlYPD培养基的配方培养基的配方HH2 2O O 定容至定容至1000mL1000mL蛋白胨蛋白胨 (peptone) 20g(peptone) 20g琼脂（琼脂（agaragar） 20g20g酵母提取物酵母提取物(Yeastextract) 10g(Yeastextract) 10g葡萄糖 1-2%

13、耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160160170170 1-2 1-2小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具70757075、30min 30min 8080、15min15min100100、56min56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）强烈强烈的理化方法，的理化方法，杀死杀死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石

14、炭酸等酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基，100KPa100KPa、121121、151530min30min二二. .无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：湿热灭菌的优点湿热灭菌法菌体吸收水分蛋白质较易凝固湿热的穿透力比干热大，水的传热能力比许多非导体的固体强湿热的蒸汽有潜热存在，1g水在100由气态变为液体态可放出2.26kJ，可增强灭菌效果培养基和玻璃器材的灭菌方法放入杀菌锅杀菌锅 (Autoclave) 灭菌加水盖过铁板放东西关门调整温度时间关紧泄压阀灭菌结束后，等压力降回零压力降回零时才可打开门进入杀菌釜 之物

15、品，盖子不可关太紧或太松拿灭菌后物品请记得带耐热手套灭过菌之固态培养基于无菌操作台无菌操作台 (Laminar flow)内倒制平板培养基 (Plate)日光灯UV灯风扇培养基和玻璃器材的灭菌方法培养基和玻璃器材的灭菌方法间歇灭菌法：间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1 1次，每次煮沸次，每次煮沸1h1h，连续连续3d3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37370 0C C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀

16、死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。培养基和玻璃器材的灭菌方法过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。培养基和玻璃器材的灭菌方法紫外线灭菌法：紫外线灭菌法： 一般一般30W30W灯管，灯管，9m9m3 3空间，距地面空间，距地面2m2m每次打开紫外线照射每次打开紫外线照射0.5h0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿

17、透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。及表面杀菌。培养基和玻璃器材的灭菌方法化学药剂消毒灭菌：微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。培养基和玻璃器材的灭菌方法本次实验报告内容本次实验报告内容记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。明其配制过程，指明要点。思考题思考题固体培养基加琼脂的作用是什么？固体培养基加琼脂的作用是什么？干

18、热灭菌和高压蒸汽灭菌和有何不同？干热灭菌和高压蒸汽灭菌和有何不同？培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌? ?若不若不能及时灭菌应如何处理能及时灭菌应如何处理? ?已灭菌的培养基如何进已灭菌的培养基如何进行无菌检查行无菌检查? ?无菌技术M的接种与分离技术微生物的培养方法微生物的生长现象与观察（一）什么是无菌技术（一）什么是无菌技术指在微生物实验工作中，控制或指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境（二）无菌环境无菌室无菌室无菌柜无菌柜超净工作台超

19、净工作台（1 1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（2）无菌室的消毒和防污染无菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外线照射（每日（使用前）紫外线照射（1212小时）小时）. .每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2 2小时）小时）. .每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。 超净台的使用与保养超净台的使用与保养: :（1 1）风速保持在）风速保持在0.32-0.480.32-0.48米米/ /秒秒; ;（2 2）使用前开启紫外灯照射）使用前开启紫外灯照射3030分钟以上

20、分钟以上; ;（3 3）让超净台预工作）让超净台预工作10101515分钟分钟; ;（4 4）使用完毕后，用）使用完毕后，用70%70%酒精将台面和台内酒精将台面和台内四周擦拭干净四周擦拭干净. . （三）无菌器材（三）无菌器材灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等等. 消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等天平、工作台、手等（四）无菌操作（四）无菌操作1 1、目的：、目的：（1 1）是保证待检物品不被环境中微生物的）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；污染；（2 2）是防止被检微生物在操作中污染环境）是防止被检

21、微生物在操作中污染环境或感染操作人员。或感染操作人员。2 2、进入无菌室前的准备、进入无菌室前的准备（1 1）、定期检查无菌环境的空气是否符合）、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；规定；（2 2）、用紫外线灭菌处理）、用紫外线灭菌处理30603060分钟；分钟；（3 3）、检查无菌器材是否完备；）、检查无菌器材是否完备；（4 4）、洗手消毒；）、洗手消毒；（5 5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1 1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2 2）、使用玻璃器皿应轻取轻放。）、使用玻璃器

22、皿应轻取轻放。（3 3）、在正火焰上方操作；）、在正火焰上方操作；（4 4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5 5）、在接种培养物时，协作应轻、准）、在接种培养物时，协作应轻、准。（6 6）、不能用嘴直接吸吹吸管。）、不能用嘴直接吸吹吸管。（7 7）、）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%5%来苏尔溶来苏尔溶液的消毒桶内消毒。液的消毒桶内消毒。 无菌操作无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞1. 接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红烧红来来菌菌，后端铁棒部分过火无菌操作 取菌技巧 12. 试管前端过火3. 打开试管盖无菌操作 取菌技巧 14. 试管倾斜倾斜，放入接种环无菌操作 取菌技巧 15. 试管前端过火，盖上试管盖6. 接种环烧红灭菌无菌操作 取菌技巧 15. 试管前端过火，盖上试管盖6. 接种环烧红灭菌无菌操作 取菌技巧 12. 自 Plate 上取单一菌落 (方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入)(方法二：plate 反面拿起)无无菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 2 21. 挤出安全吸安全吸球球内空气，插上灭过菌之玻璃吸管2.