第二章提取分离方法

1、第二章第二章中药化学成分的一般研究方中药化学成分的一般研究方法法第一节 中药化学成分及生物合成简介v一、中药化学成分类型简介一、中药化学成分类型简介v1 1、糖类、糖类单糖、低聚糖、多糖大多属于水溶性成分。单糖、低聚糖、多糖大多属于水溶性成分。v2 2、苷类、苷类糖和非糖物质通过糖的端基糖和非糖物质通过糖的端基C C原子链接而成的原子链接而成的化合物。化合物。v 苷苷 苷元苷元 苷多亲水苷多亲水 苷元偏亲脂苷元偏亲脂OOHOHOHOHOOHOHOHv3、醌类醌类分子中具有醌式结构的化合物分子中具有醌式结构的化合物v 萘醌类萘醌类v分子含酚羟基，有一定酸性，可溶于碱水。分子含酚羟基，有一定酸性，

2、可溶于碱水。v4 4、苯丙素类苯丙素类含有含有C C6 6C C3 3骨架的化合物骨架的化合物v（1 1）香豆素：香豆素：邻羟基桂皮酸形成的酯，分子多含酚羟基，邻羟基桂皮酸形成的酯，分子多含酚羟基，偏亲水性偏亲水性 （2）木脂素木脂素：具有：具有2个个C6C3骨架的衍生物骨架的衍生物 OOOHOOOHv5、黄酮、黄酮具有具有C6C3 C6骨架的衍生物骨架的衍生物 异牡荆素异牡荆素v多含酚羟基，显酸性，可溶于碱水。多含酚羟基，显酸性，可溶于碱水。v6、萜和挥发油、萜和挥发油分子式符合（分子式符合（C5H8）n通式的化合物。通式的化合物。v 薄荷醇薄荷醇 龙脑龙脑v挥发油有挥发性，可随水蒸汽蒸馏。

3、挥发油有挥发性，可随水蒸汽蒸馏。OOOHglcOHOHOHOHv7、生物碱生物碱含含N有机化合物，有碱性，可溶于酸有机化合物，有碱性，可溶于酸水。水。v8、甾体类化合物甾体类化合物含甾体母核的化合物。含甾体母核的化合物。龙胆碱龙胆碱NOOOHOHOOOv9、三萜化合物三萜化合物基本骨架由基本骨架由30个个C组成。组成。v10、鞣质鞣质复杂的多元酚类化合物总称。复杂的多元酚类化合物总称。 没食子酸没食子酸 逆没食子酸逆没食子酸v属于水溶性成分。属于水溶性成分。CH3CH3CH3CH3CH3HHHCH3CH3CH3HOHOHOHOHCOOHOOOOOHOHOHOH二、各类中药化学成分的主要的生物合

4、成途径二、各类中药化学成分的主要的生物合成途径v类型分类类型分类vC2单位（单位（CH3COOH）：脂肪酸、酚酸、苯醌、等）：脂肪酸、酚酸、苯醌、等聚酮类聚酮类vC5单位（异戊二烯）：萜类、甾类单位（异戊二烯）：萜类、甾类vC6单位单位 ：香豆素、木脂素等苯丙素类化合物：香豆素、木脂素等苯丙素类化合物 v氨基酸：如生物碱类氨基酸：如生物碱类v复合单位：由上述单位复合构成复合单位：由上述单位复合构成v（一）醋酸（一）醋酸 丙二酸途径丙二酸途径 （AAMA途径）途径）v产物：脂肪酸、酚类、蒽醌等产物：脂肪酸、酚类、蒽醌等v 1、脂肪酸、脂肪酸 v 饱和脂肪酸饱和脂肪酸AAMA途径途径 (乙酰丙二酸

5、酯途径：缩合乙酰丙二酸酯途径：缩合 、还原、还原 ) 不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸 氧化成羟基衍生物氧化成羟基衍生物 （ 脱水而成脱水而成 ）v（注：（注：ATP：三磷酸腺苷：三磷酸腺苷 ADP：二磷酸腺苷）：二磷酸腺苷）v2、酚类、酚类 AAMA途径：只有缩合途径：只有缩合v3、醌类、醌类 在在 AAMA途径中由多酮环合成各种醌类和聚酮类途径中由多酮环合成各种醌类和聚酮类v（二）甲戊二羟酸途径（二）甲戊二羟酸途径（ MVAMVA）v产物产物 萜类、甾体类萜类、甾体类vMVA MVA 头头尾尾 DMPDMP（焦磷酸二甲烯丙酯）（焦磷酸二甲烯丙酯） v IPP (IPP (焦磷酸异戊烯酯焦磷酸异戊烯

6、酯) ) v氧化、还原、脱羧、缩合、重排氧化、还原、脱羧、缩合、重排v 反式角鲨烯反式角鲨烯 三萜、甾类三萜、甾类v（三）莽草酸途径（桂皮酸途径（三）莽草酸途径（桂皮酸途径 ）v产物产物v具有具有C6-C3 骨架的苯丙素衍生物：香豆骨架的苯丙素衍生物：香豆 素、木质素、木脂素等素、木质素、木脂素等v具有具有 C6-C3-C6 骨架的衍生物：黄酮类骨架的衍生物：黄酮类v前体前体 苯丙氨酸苯丙氨酸 v（四）氨基酸途径（四）氨基酸途径 （aa途径）v产物产物 生物碱生物碱 v前体前体 乌氨酸乌氨酸 、赖氨酸、赖氨酸脂肪胺脂肪胺 （TCA循环中循环中酮酸还原氨）酮酸还原氨） v苯丙氨酸、酪氨酸苯丙氨酸

7、、酪氨酸 、色氨酸、色氨酸 芳香族生物碱芳香族生物碱（莽草酸途径）（莽草酸途径）（五）复合途径（五）复合途径v1、AAMA途径途径 莽草酸途径莽草酸途径v2、AAMA途径途径 MVA途径途径v3、aa MVA途径途径v4、aa AAMA途径途径v5、aa 莽草酸途径莽草酸途径第二节第二节 中药化学成分的提取分离方法中药化学成分的提取分离方法 一、中药有效成分的提取方法一、中药有效成分的提取方法（一）溶剂提取法（一）溶剂提取法v依据：化学成分的溶解性（极性）v关键：提取溶剂的选择v溶剂的选择原则：相似相溶的原则，价廉、易得、无毒、安全等。v提取方法：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提

8、取法。 提取溶剂提取溶剂 性能特点性能特点 适宜提取成分适宜提取成分 提取方法提取方法强极性溶剂 溶解范围广（酸水、碱水） 生物碱盐 穿透能力强 苷类 价廉易得、安全 糅质 煎煮法 糖类 渗漉法 水 有些脂溶性成分溶解不完全 氨基酸 （酸水） 有些苷类成分的酶解 蛋白质 水提液易发霉、变质 水溶性杂质多，过滤困难 沸点高，浓缩困难常用提取溶剂性能特点 提取溶剂提取溶剂 性能特点性能特点 适宜提取成分适宜提取成分 提取方法提取方法 除去多糖、 溶解范围广（不同浓度乙醇） 蛋白质外 渗滤法（稀醇） 水溶性杂质溶出少 的大多数 浸渍法 乙醇 可抑制酶的活性 化学成分 回流法 提取液不易发霉、变质 均

9、可 连续回流法 大部分可回收利用 但有挥发性、易燃烧 甲醇 溶解特点与乙醇相似，但有毒 丙酮 溶解性能同乙醇，但沸点低、易挥发，作为提取溶剂不常用； 但对色素溶解性能好，在分离、精制时常用。 亲水性有机溶剂（和水可任意混溶）常用提取溶剂性能特点 提取溶剂提取溶剂 性能特点性能特点 适宜提取成分适宜提取成分 提取方法提取方法 对化合物溶解选择性较强;水溶性杂质少、易纯化 ; 游离生物碱 回流法挥发性大、易燃烧、有毒 ; 苷元 连续回流法价格昂贵，对提取设备要求高; 某些苷类穿透力较弱，提取时间长;作为提取溶剂不常用。 如:乙醚 bp. 35，极易燃 氯仿 bp. 61、d 1. 480，不易燃，

10、毒性大,对生物碱溶解性好 苯 bp. 80.1，毒性大 石油醚 沸程 3060、6090、90120 脱脂、脱色常用 于甲醇、乙醇不能任意混溶。亲脂亲脂性有性有机溶剂机溶剂常用提取溶剂性能特点v（二）水蒸气蒸馏法（二）水蒸气蒸馏法v适用于挥发性成分（主要是挥发油）的提取（三）二氧化碳超临界流体萃取技术（三）二氧化碳超临界流体萃取技术（COCO2 2 - SFE - SFE）超临界流体萃取技术超临界流体萃取技术：以超临界流体作为萃取介质的一种提取新技术。超临界流体超临界流体：处于临界温度（Tc）、临界压力（Pc）以上，介于气体与液体之间的流体。特点特点：具有液体和气体的双重特性。如：密度与液体近

11、似黏度与气体近似，对很多物质有很强的溶解能力，扩散系数是液体的100倍（不及气体）中药提取常用的超临界流体 CO2的优点：v 1. 临界温度（Tc=31.4）接近室温, 热敏成分稳定。v 2. 临界压力（Pc=7.37 MPa）不太高, 易操作。v 3. 本身呈惰性，与化合物不反应。v 4. 价格便宜。超临界流体萃取中药成分的主要优点：v 1. 可以在接近室温下工作，防止热敏成分的破坏或逸散。v 2. 萃取过程几乎不用有机溶剂，萃取物中无溶剂残留，对环境无污染。v 3. 提取效率高，节约能耗。二 、中药化学成分分离与精制方法 分离依据分离依据 分离方法分离方法 分离原理或特点分离原理或特点 二

12、相萃取法 分配系数（K）差异 逆流分溶法（CCD） 液滴逆流色谱法（DCCC） 高速逆流色谱法（HSCCC） 液-液分配柱色谱 正相色谱和反相色谱 加压液相色谱法 正相色谱和反相色谱 快速色谱 低压液相色谱（LPLC） 中压液相色谱（MPLC） 高压(效)液相色谱法（HPLC） 分配系数（分配系数（K）差异）差异 溶剂沉淀法溶剂沉淀法:1.水提醇沉法（水/醇法） 除去多糖、蛋白质等水溶性杂质2.醇提水沉法（醇/水法） 除去树脂、叶绿素等脂溶性杂质3.醇/醚（丙酮）法 皂苷的纯化（除去脂溶性杂质）4.酸/碱法 生物碱的分离纯化 5.碱/酸法 酸性成分（如苷元）的分离纯化试剂沉淀法试剂沉淀法:1.

13、钙、钡、铅盐沉淀法 酸性成分的分离2.生物碱沉淀试剂沉淀法 生物碱的分离纯化3.结晶及重结晶 化合物的进一步精制溶解度差异溶解度差异中药化学成分分离与精制方法物理吸附（表面吸附）特点物理吸附（表面吸附）特点: 无选择性、吸附可逆、可快速进行，应用较多 如: 硅胶 极性吸附剂 氧化铝 极性吸附剂 吸附性差别 活性炭 非极性吸附剂化学吸附的特点化学吸附的特点: 有选择性、吸附牢固或不可逆、洗脱难，应用少。 如: 碱性氧化铝 对酚酸类（黄酮、蒽醌）的吸附强 酸性硅胶 对生物碱的吸附强吸附性差别吸附性差别 中药化学成分分离与精制方法半化学吸附的特点半化学吸附的特点：吸附力介于上述二者之间，较弱。 如:

14、 聚酰胺 （氢键吸附） 大孔吸附树脂吸附原理（范德华引力或产生氢键） 分子筛原理（本身多孔性结构的性质决定的）吸附性差别吸附性差别 中药化学成分分离与精制方法中药化学成分分离与精制方法透析法 (半透膜膜孔的分子筛作用)凝胶滤过法 (三维网状结构的分子筛作用) 超滤法 (分子大小不同引 起的扩散速度的差别) 超速离心法 (溶质在超速 离心作用下沉降性的差别) 蛋白质的脱盐精制 蛋白、多糖的分离及 小分子化合物的分离 大分子化合物精制分离 同上。 分子大小差别分子大小差别 中药化学成分分离与精制方法中药化学成分分离与精制方法 阳离子交换树脂 离子交换树脂法 阴离子交换树脂 应用：用于氨基酸、生物碱

15、、有机酸的分离） 离解程度不同离解程度不同中药化学成分分离与精制方法中药化学成分分离与精制方法常用色谱分离方法介绍常用色谱分离方法介绍 吸附色谱吸附色谱吸附剂吸附剂 分离原理分离原理 吸附规律吸附规律 应用应用 硅胶 吸附原理 弱酸性、极性吸附剂 广泛（酸、碱及 化合物极性越大、 中性成分均可） 吸附能力强（难洗脱） 溶剂极性越小，吸附力越强 氧化铝 吸附原理 碱性、极性吸附剂 碱性、中性成分 吸附规律同上 （ 酸性成分与铝络合）活性炭 吸附原理 非极性吸附剂 从稀水溶液中富集微量物 吸附规律与上相反 脱色（脂溶性色素） 吸附剂吸附剂 分离原理分离原理 吸附规律吸附规律 应用应用 聚酰胺 氢键

16、吸附 酚羟基数目多，吸附力强 能形成分子内氢键者，吸 黄酮、蒽醌的分离 附力下降 母核芳香化程度高者，吸 附力增强，水（介质）中 除鞣质 吸附力强，水洗脱力弱 大孔吸附树脂 吸附原理 非极性化合物易被非极性 树脂吸附 糖与苷的分离 分子筛原理 溶剂中溶解度增大，吸附 力下降 （从水提液富集苷 非极性树脂，极性小的溶 剂洗脱力强 生物碱的精制常用色谱分离方法介绍常用色谱分离方法介绍 类类 型型 固定相固定相 流动相流动相 应应 用用正相色谱 水 BAW系统 极性、中极性物质分离（以PPC为例）反相色谱 ODS 20.2 105 1mg左右制备用高压液相色谱（HPLC） 5mg中压液相色谱 ( M

17、PLC ) 5.0520.2 105 100mg低压液相色谱 ( LPLC ) 10mg 类类 型型 原原 理理 溶胀溶剂溶胀溶剂 应应 用用葡聚糖凝胶 分子筛（大小） 水 多糖、多肽、（Sephadex G） 蛋白质分离 羟丙基葡聚糖凝胶 分子筛（糖苷） 水、极性有机溶剂 适于不同类型（SephadexLH-20）吸附原理（苷元） 或二者的混合溶剂 化合物分离葡聚糖凝胶色谱葡聚糖凝胶色谱 离子交换吸附树脂离子交换吸附树脂树脂类型树脂类型 原原 理理 应应 用用阳离子交换树脂 离子交换 从酸水溶液中 吸附碱性成分（生物碱） 强酸性（R-SO3-H+） （阳离子） （除去酸性、中性成分）弱酸性（

18、-COO-H+）阴离子交换树脂 离子交换 从碱水溶液中 吸附酸性成分（有机酸）强碱性（RN+(CH3)3CI-） （阴离子） （除去碱性、中性成分）弱碱性 (伯、仲、叔胺) 第三节、中药有效成分化学结构的研究方法第三节、中药有效成分化学结构的研究方法（一）化合物纯度的判定方法（一）化合物纯度的判定方法v1结晶均匀、一致。v2熔点明确、敏锐（0.51.0）。v3TLC (PPC):三种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点。v4HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。（二）四大光谱在结构测定中的应用（二）四大光谱在结构测定中的应用v紫外 可见光谱（UV -VIS） 共轭体系特征v分子中电子跃迁（从

19、基态至激发态）。其中，n-*、-* 跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现在光的紫外区和可见区（200700nm）。 200nm 400 700nm 紫外区（UV） 可见区（VIS） 应用：应用：v推断化合物的骨架类型 共轭系统v取代基团的推断 如：加入诊断试剂推断黄酮的取代模式（类型、数目、排列方式）v用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）（三）四大光谱在结构测定中的应用（三）四大光谱在结构测定中的应用红外光谱红外光谱（IR）分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外光谱。4000 3600 3000 1500 1000 625cm-1特征频率

20、区 指纹区 特征官能团的鉴别 化合物真伪的鉴别 羟基（酚羟基、醇羟基） 36003200 cm-1 游离羟基 3600 cm-1 氢键缔合羟基 34003200 cm-1 羰基 16001800 cm-1酮 1710 cm-1酯 17101735 cm-1芳环 1600、1580、1500cm-1 有23个峰 双键 16201680 cm-1 两个化合物完全相同的条件 1、 特征区完全吻合 2、 指纹区也需完全一致 红外光谱红外光谱（IR）1H-NMR（核磁共振氢谱）v信息参数：化学位移（）、峰面积、峰裂分v（s 、d、t、q、m）及偶合常数（）（1）化学位移（ppm）: v 与1H核所处的化

21、学环境（1H核周围的电子云密度）有关v 电子云密度大，处于高场，值小v 电子云密度小，处于低场，值大1H-NMR（核磁共振氢谱）（核磁共振氢谱）0.9-C-CH3 1.8-C=C-CH32.1-COCH3 3.0-NCH3 3.7-OCH3 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0-COOH -CHO Ar-H -C=C-H 常见结构的化学位移大致范围常见结构的化学位移大致范围（要求熟记）（要求熟记） (ppm) 推断化合物的结构（含1H核基团的结构） （二）峰面积（二）峰面积: 磁等同质子的数目磁等同质子的数目 用积分曲线面积（高度）表示用积分曲线面积（高度）表示磁不等同两个或两组

22、1H核在一定距离内相互自旋偶合干扰，发生的分裂所表现出的不同裂分 符合 n+1 规律 ( n = 磁等同质子的数目 ) 用偶合常数（J）表示 峰裂分的数目 峰裂分的距离 不同系统偶合常数 (J Hz) 大小s 单峰 d 双峰 t 三重峰 q 四重峰 m 多重峰 芳环 J邻610Hz；J间 03Hz ；J对01Hz 双键 J顺711 Hz；J反1218 Hz饱和烃类相邻碳原子上质子偶合常数的大小与两个氢原子之间的立体夹角有关： =60O J = 24 Hz =180 O J = 910 Hz 环己烷及其类似物相邻碳原子上质子的偶合常数： Jaa 1013Hz ( =180 O )；Jae 25H

23、z ( =60 O ) Jee 25Hz ( =60 O )（三）峰裂分及偶和常数（三）峰裂分及偶和常数1H-NMR核磁核磁共振辅助技术共振辅助技术v（1）重氢 (D2O) 交换 推断活泼质子（羟基）的存在与否。v（2）核增益效应（NOE）：指在核磁共振中选择性照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一或数个质子信号强度增高的现象。v（3）溶剂位移：苯诱导位移 由于溶剂分子（苯）的接近，对化合物将发生不同的屏蔽及去屏蔽作用，使质子化学位移发生变化的现象。13C-NMR（ 核磁共振碳谱核磁共振碳谱 ）vFT-NMR: 即脉冲傅里叶变换核磁共振。其装置原理为采用强的脉冲照射使分子中

24、所有的13C 核同时发生共振，生成在驰豫期内表现为指数形式衰减的正弦波信号（自由诱导衰减；FID），再经傅里叶变换即成为正常的NMR 信号。随着脉冲扫描次数的增加及计算机的累加计算，13C 信号将不断得到增强，噪音则越来越弱。经过若干次的扫描及累加计算，最后即得到一张好的NMR谱。 由于该装置的出现及计算机的引入，才使得13C-NMR用于有机化合物结构研究成为可能。v信息参数：化学位移（C）、异核偶合常数（JCH）、驰豫时间（T1） 不同 13C 核C大小与13C 核所处的化学环境（周围电子云密度）有关 用于13C 核类型的推断 ( C ppm ) 150220( c=o) 200 150 1

25、00 50 0 c=c Ar 5080 (c-o) 饱和碳原子（060） 主要结构13C 核C的大致范围 ( 要求熟记 ) （1）化学位移：大致范围（）化学位移：大致范围（C）0200ppm常用常用13C- NMR测定技术及其特征测定技术及其特征 v(1)质子宽带去偶（BBO）: 也叫全氢去偶（COM）、噪音去偶。采用宽频电磁辐射照射所有1H核使之饱和后测得的13C- NMR谱（即去掉所有氢核对碳核的偶合影响）。特征：图谱简化，每个碳原子都为单峰，互不重叠。方便于判断碳信号的化学位移。伯、仲、叔碳峰增强，季碳为弱峰（照射1H核产生NOE效应）无法区别碳上连接的1H核数目。（2）偏共振去偶：（此

26、法现已基本上被）偏共振去偶：（此法现已基本上被DEPT所替代）所替代）仅保留直接与碳原子相连1H核对碳的偶合J 1CH（即去掉氢核对碳核的远程偶合J 2CH J 3CH） 伯（-CH3) 四重峰 （q）仲（-CH2-) 三重峰 ( t ) 叔（-CH-) 双峰 ( d ) 季（-C-） 单峰 ( s ) 碳核（伯、仲、叔、季）类型的判断 特征（3）DEPT (无畸变极化转移增强法无畸变极化转移增强法) ：（为（为13C- NMR谱的一种常规测定方法）谱的一种常规测定方法） 系通过改变照射1 H核的脉冲宽度（或设定不同的驰豫时间）使不同类型13C信号在谱图上呈单峰，并分别呈现正向峰或倒置峰 脉冲

27、宽度脉冲宽度 峰的特征峰的特征=450 CH3 CH2 CH ( 代表正向峰)=900 CH =1350 CH3 CH CH2 （ 代表倒置峰） 可用于区别伯（CH3）、仲（CH2）、叔（CH）碳信号与质子宽带去偶谱比较，还可以确定季碳（-C-）信号 二维核磁共振谱（二维核磁共振谱（2D-NMR谱）谱） 质谱质谱（MS）:v1确定分子量（高分辨质谱 可将分子量精确到小数点后三位）, 计算分子式。v2提供其他结构信息。如黄酮类，依碎片离子峰可以确定A-环, B-环的取代模式。v3与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同条件下，其裂解是符合一定规律的）。v4依裂解特征及碎片离子 推定或复核未知化合物分子的部分结构。 质谱主要离子源的电离方式及特点质谱主要离子源的电离方式及特点 （1）电子轰击质谱（）电子轰击质谱（EI-MS）：）：目前常用。但对于热敏成分及难于气化的成分（醇、糖苷、部分羧酸等）大分子物质（多糖、肽类）难以气化 测不到分子离子峰亦无法测得分子量 电离新方法 （样品不必加热气化而直接电离） 化合物乙酰化或三甲基硅烷化（TMS化）制成热稳定性好的挥发性衍生物进行测定 质谱主要离子源的电离方式及特点质谱