筋脉通含药血清对高糖培养的省略酶表达影响

1、· 299 ·In egra ve M ed c ne, M arch 20 , Vol .9 , No .3中西医结合学报 20年 3 月第 9 卷第3 期 Jou rnal o C hO riginal Experimental Research 实验论著筋脉通含药血清对高糖培养的 Schwann 细胞诱导型一氧化氮合酶和 NADPH 氧化酶 p22 phox表达的影响1, 梁晓春1 ,医学科学院医学科学院2 ,艳1 ,1 ,智1 ,11 .2 .协和医学院协和医院中医科,协和医学院基础医学研究所细胞中心,100730100005目的 :探讨筋脉通含药血清对高糖培养的

2、Schw ann 细胞诱导型一氧化氮合酶(i nducible nitric oxide synthase , iNOS)蛋白表达及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate , NADPH)氧化酶 p22 pho xm RNA 表达的影响。:雄性 Wistar 大鼠随机分为 3 组, 分别灌胃筋脉通 、维生素 C 或蒸馏水含药血清和对照血清。取新出生大鼠的双侧坐骨神经用于Schw ann 细胞。将体外培养的 Schw ann 细胞分为高糖组、筋脉通组(加入筋脉通含药血清)、维生素 C 组(加入维生素 C 含药血清)及正常对照

3、组。培养 48 h 后, 采用免疫荧光法检测 Schw ann 细胞内iNOS 蛋白的表达, 实时荧光定量聚合酶链式反应法检测 NADPH 氧化酶p22 phoxm RNA 的表达。结果:高糖培养的 Schw ann 细胞内iNOS 蛋白表达及NADPH 氧化酶p22 phoxm RNA 表达均较正常对照组明显升高(P <0 .01);与高糖组比较, 筋脉通组iNOS 蛋白表达及NADPH 氧化酶p22 phoxmRNA 表达明显降低(P <0 .01), 且明显优于维生素C 组(P <0 .01)。结论 :筋脉通含药血清可以下调高糖培养的 Schw ann 细胞iNOS 蛋

4、白及 NADPH 氧化酶 p22m RNA 的表达。:高糖;Schw ann 细胞;诱导型一氧化氮合酶;N ADPH 氧化酶;中草药phoxOpen Access 开放获取Related Articles 推荐阅读DOI :10 .3736/ jcim20110311http:/ / ww w .jcimjournal .com, 梁晓春,艳,智,.筋脉通含药血清对高糖培养的 Schw ann 细胞诱导型一氧化氮合酶和 N AD PH 氧化酶 p22 pho x 表达的影响.中西医结合学报.2011 ;9(3):299 305 .Z hao L , Liang XC , Zhang H , W

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9、at http:/ / www .jcimjournal .com/ FullText 2. aspx ?ar ticleID =617More related articles at FullText 2. aspx ?ar ticleID =jcim20110311· 300 ·Journal o ChIn egra ve M ed c ne , M arch 20 , Vol .9 , No .3中西医结合学报 20 年 3 月第 9 卷第 3 期实验研究表明,大鼠坐骨神经中活性氧iodide , PI)(博士德生物工程);RN A簇(reactive o xy ge

10、n species , ROS)的增加导致一氧化氮合酶(ni t ric oxide sy nthase, NOS)介导的硝化抽提试剂盒 、S YBR Green 荧光聚合酶链式反应(poly merase chain reactio n , PCR)试剂盒生物应激, 是周围神经病变(diabetic peripheral医学技术() ;M M LV 逆转录酶 普 ;其余试剂购自北。CO 2 培养箱(neuropathy , DPN)的重要发病机制之一。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate , NADPH)氧化酶是 R

11、OS 的重要来源之一, 使用 NADPH 氧化酶抑制剂治疗DPN 已经引起广泛重视 1 , 2 。 Schw ann 细胞(Schw ann cell , SC)是周围神经系统特有的神经胶质细胞, 在DPN中担当着重要的角色, 高糖导致的周围神经损伤以及损伤后的修复过程都离不开SC 的参与 3, 。既洛()生物技术京中杉金桥生物技术Therm o 公司), 倒置相差显司), 激光扫描共聚焦显(Olympus 公(德国 Leica 公司),Line gene 荧光定量 PCR 检测系统(杭州博日科技)。1 .2 实验1 .2 .1SC 的原代培养 、纯化及鉴定 按照前期实验结果进行 7 , 简要

12、往临床及实验研究表明, 筋脉通胶囊能够如下 :处死乳鼠 , 切取双侧DPN患者的临床症状, 增加神经传导速度 5 ;显著提高糖尿病大鼠超氧化物歧化酶活性, 降低脂质过氧化物丙二醛的水平, 具有抗氧化作用 6 。为进一步探讨其作用机制, 本实验拟以SC 为靶细胞, 体外观察筋脉通含药血清对高糖培养的 SC 中诱导型一氧化氮坐骨神经剪碎至 0 .5 1 .0 mm3 , 加入含DMEM + 20 %胎牛血清的工作培养基 , 置于 5 % CO 2 37 培养箱中培养。48 h 后首次换液, 2 3 d 换液一次。当细胞长至 70 % 80 %面积时 , 用 0 .05 %胰蛋白酶37 消化 2 3

13、 min , 差速贴壁 60 min , 以 1105个/ mL密度接种, 培养 3 4 d , 加入含 100 g/ mL G 418 的培养液纯化 4 5 d , 换用工作培养基继续培养。取第 3 代SC 进行 S 100 蛋白免疫组织化学鉴定, 胞浆显棕黄色者为阳性细胞。合酶(inducible nitric oxideNADPH 氧化酶p22 phoxsynthase , iNOS)和表达的影响。1 材料与1 .1实验材料1 .1 .1 实验动物1 .2 .2含药血清及正常大鼠血清的雄性新生 3 5 d 雄性 Wistar 乳鼠,Wistar 大鼠适应性喂养 24 h 后随机分为 3

14、组灌胃,JM T 组:按成人剂量 15 倍给药, 即 1 .31 g/(kg · d);VC 组:按成人剂量 15 倍给药, 即 0 .08 g/(kg ·d);正购自医学科学院实验动物研究所, 动物证号为SCXK (京)2005 0013 , 用于原代细胞培养 ;雄性Wistar 大鼠, 体质量 200 250 g , 购自维通常对照组:予同等体积蒸馏水。灌胃 2 次, 连续利华实验动物技术SCXK(京)2007 0001 , 用于, 动物含药血清。证号为3 d 。末次灌胃后 2 h 内颈动脉取血, 室温静置 2 h后, 3 200g 离心 10 min 分离血清, 5

15、mL EP 管分装80 保存备用以避免反复冻融 , 用时 56 水浴灭活 30 min , 0 .22 m 滤器过滤。1 .1 .2实验筋脉通(Jinmaitong , JM T)胶囊(由菟丝子 15 g 、女贞子15 g 、桂枝10 g 、延胡索 10 g 、水蛭 6 g 、细辛 3 g 等组成), 由九龙制药厂生产,1 .2 .3分组及含药血清干预根据既往实验结每粒含生药 0 .35 g , 批准文号为(97)药制加字果 7, 高糖浓度定为 50 mmol/ L , 1 2 稀释的 JMT 48 第 F 292 号, 生产批号为 061019 。维生素 C含药血清作为干预浓度,作用后的第

16、48 小时作细胞, 消化后分为(vitamin C , VC), 购自双鹤药业,为观察点。取第 3长良0 .1, 批准文号为国药准字 H11021503, 生产批4 组:(1)正常对照组:DMEM +20 %正常大鼠血清; (2)高糖组:DMEM +50 mmol/ L 葡萄糖 +20 %正常大鼠血清;(3)VC 组:DMEM +50 mmol/ L 葡萄糖+ 20 % VC 含药血清;(4)JMT 组:DMEM +50 mmol/ L 葡萄糖 +10 % JM T 含药血清+10 %正常大鼠血清。1 .2 .4实时荧光定量PCR 技术检测SC 内NADPH号为 080213 。1 .1 .3

17、主要试剂与仪器养基(Dulbecco s modified Eng le改良培s medium , DM EM)(高糖型,Gibco 公司);胎牛血清 、胰蛋白酶(美国H yClone 公司);G 418(Sig ma 公司);兔抗大鼠iNOS 多克隆抗体、兔抗大鼠 NADPH 氧化酶氧化酶p22 phoxm RNA 的表达p22 pho x多克隆抗体猪抗兔荧光二抗, 异硫Santa Cruz 公司);酸荧光素(f luo rescein1 .2 .4 .1RNA 的提取和鉴定 取第 3 代 SC 消化后按 1106 个/瓶的浓度接种于 T 25 培养瓶内, 按上述分组加入含药血清后置于 5

18、% CO2 、37 培养箱培养 48 h 。PBS 漂洗, 用TRIzo l 试剂提取细胞总isothiocy anate , FI TC)标记(丹麦 Dako 公司);兔抗大鼠 S 100 多克隆抗体、碘化丙啶 (pro pidium· 301 ·ve M ed c ne, M arch 20 , Vol .9 , No .3中西医结合学报 20年 3 月第 9 卷第3 期 Jou rnal o C hIn egraRNA , 氯仿和乙醇抽提。以 1 %琼脂糖凝胶电泳检查RNA 的完整性, 28S 和 18S 条带清晰可见, 表明RNA 无降解。紫外分光光度计对 RNA

19、浓度和纯度爬片, 4 %多聚甲醛室温固定 1 h ;0 .1 % Triton X 100室温打孔10 min ;山羊血清封闭液室温孵育20 min ; 兔抗大鼠iNOS 多克隆抗体(1 20)4 孵育过夜;猪抗兔荧光二抗/ FITC 37 孵育30 min ;PI 避光室温复染 5 min ;防荧光淬灭剂封片;共聚焦激光扫描显下观察并照相, 所摄图像以 Leica Confocal 图像进定, 检测波长为 280 nm 和260 nm 时的吸光度(absorbance , A)值, A260 / A280 比值在 1 .8 2 .0 。1 .2 .4 .2cDN A 的在离心管中加入 3 L

20、 模板RNA (1 g/L )、0 .5 L 引物 Oligo (dT )15 , 50 mol/ L ,加水至 15 L 体系。混匀后 70 变性 RNA 5 min , 冰上急冷 2 min , 离心将溶液收集至管底, 加入 5 L 5 PCR 缓冲液、1 .25 L dNTP 混合液 (10 mmol/ L)、25 U RNA 酶抑制剂(40 U/ L )、 200 U M MLV (200 U/ L), 加水至 25 L 体系。42 延伸 1 h , 70 保温15 min 后冰上冷却。分析检测绿色荧光强度。实验重复 3 次, 每次计数 10 个细胞, 每组共计数 30 个细胞。1 .

21、3 统计学行统计。数据用 x采用 SPSS 13 .0 统计包进s 表示, 采用单样本K S 拟合优度法(O ne Sample K S Test )检验数据是否符合正态分布。iNOS 蛋白表达各组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用最小显著差值法(least sig nif icant dif ference , LSD);N ADPH 氧化酶p221 .2 .4 .3引物的设计与生物医学技术(所测基因的引物由利用 Primer)m RNA 表达采用多个样本非参数检(K Independent Samples Test )。以 P <pho x验5 .0 及 Oligo 6 .0

22、生物设计并5T A T TG TTG。引物序列:上游0 .05为差异有统计学意义 。p22 pho xCAGGAG TGC TCA 3, 下游 5CA CAGCGGTCAGGTACTTCT 3(扩增片段长度 103 bp); actin 引物序列:上游 5CCCATCTATG AGGGTTACGC 3, 下游 5T TTAATGTCACGCACGATTTC 3(扩增片段长度 150 bp)。2结 果2 .1 JM T 含药血清对高糖培养SC 内NADPH 氧化酶p22 phoxmRNA 表达的影响 与正常对照组比较, 高糖组的 p22 phoxm RNA 水平明1 .2 .4 .425 L 2

23、SYBR Green 实时定量 PCR 检测SYBR Mix 、1 L 上游引物、1 L 下游引物、显升高(P <0 .01)。JM T 组和VC 组m RNA 水平均较正常对照组升高, 其中 VC 组差异有统计学意义(P <0 .01);与高糖组比较, JM T 组和 VC 组 m RNA 水平均降低, JM T 组差异有统计学意义(P <0 .01)。干预组间比较, JM T 组 mRNA 水平明显低于VC 组(P <0 .05)。见表 1 。2 .2 JM T 含药血清对高糖培养SC iNOS 蛋白表达的影响 iNOS 主要表达于SC 的胞浆中。正常对照组表达最弱

24、, 高糖组表达最强, JM T 组和VC 组表达亦较强, 但均较高糖组减弱。荧光强度定量结果见表2 , 与正常对照组比较, 高糖组iNOS 的荧光强度值明显升高(P <0 .01);JMT 组和VC 组iNOS的荧光强度值均较正常对照组明显升高(P <0 .01), 较高糖组明显降低(P <0 .01)。干预组间比较 , JM T 组iNOS 荧光强度值明显低于VC 组(P <0 .01)。见图 1 。0 .3 L Taq DNA 聚合酶 、2 L cDNA 模板, 加水至50 L 。PCR 扩增反应条件:95 2 min , 95 20 s ,58/ 59 25 s

25、, 72 30 s(共45 个循环)。将所扩增的PCR 产物进行溶解曲线分析, 反映PCR 反应的特异性。溶解曲线生成的反应程序为 95 15 s , 60 15 s , 95 15 s(步进 0 .5 / s)。整个过荧光, 反应结束后, 使用 Sequence Detection收集Softw are 2 .2 对数据进行处理。计算出每份样品中进行 PCR 扩增时达到阈值时的 CTp22 pho x值, 并通过 actin 校正, 得到每份样品中的相对表达量(p22/ actin)。实验重复 3 次, 每次 2 个重复。 1 .2 .5 免疫荧光双标记法检测SC 内iNOS 蛋白的表达 按

26、上述分组含药血清干预 48 h 后, 制作细胞表 1 筋脉通含药血清对高糖培养的 Schwann 细胞内 NADPH 氧化酶 p22 phoxmRNA 表达的影响Table 1 Effects of Jinmaitong medicated serum on NADPH oxidase p22 phox subunit of Schwann cells cultured in high glucose medium(x ±s)Qu an y (p22 -ac n)GroupnNor al con rol , 20 % nor al seru0 .03 60 .274 00 .53 0

27、0 .226 90 .008 30 .028 8 3333H gh glu cose (50ol L), 20 % n oral seru 0 % norJ n a ong-con a n ng seru V a n C-con a n ng seru( 0 %), al seru plus 50ol L glucoseolL glucose0 .0 3(20 %)plus 500 .07 8 * P <0 .0 , vs nor al con rol group ; P <0 .0 , vs h gh glucose group ;P <0 .05 ,a n C group

28、 .NADPH :n co na devs vde hosph a .adn n d nucl· 302 ·In egra ve M ed c ne , M arch 20 , Vol .9 , No .3中西医结合学报 20 年 3 月第 9 卷第 3 期 Journal o Ch表 2 筋脉通含药血清对高糖培养的 Schwann 细胞内 iNOS 蛋白表达的影响Table 2 Effects of Jinmaitong medicated serum on iNOS of Schwann cells cultured in high glucose medium(x &

29、#177;s)GroupnFluores cenn en s yNor al con rol , 20 % nor al seru0 .5287 .3623 .6962 .040 .325 .69 .02 3 .26 30303030H gh glu cose (50ol L), 20 % n oral seru0 % norJ n a ong-con a n ng seru ( 0 %),al seru plus 50 ol L glucoseolL glucoseV a n C-con a n ng seru (20 %)plus 50P <0 .0syn hase., vs nor

30、 al con rol g rou p ;P <0 .0 , vs h gh glucose group ;P <0 .0, vs vn C group .NOS :nduc b le nar c ox de图 1 免疫荧光法检测高糖培养的 Schwann细胞内 iNOS 蛋白的表达(激光扫描共聚焦显, ×400)Figure 1 Expression of iNOS in Schwann cells cultured in high glucose medium tested by immunofluorescence method(Confocal laser sca

31、nning microscopy , ×400)S chw ann cells w ere ncuba ed w h an - nduc b le n r c ox de syn hase (NOS)and s a ned by luoresce n so h ocyana e (green);nu cle werecoun ers a ned b y p rop d uod de (red).A :Con rol group ;B :H gh g lucose (50ol L)g rou p ;C :J n a ong-con a n ng seru ( 0 %)ol L gluc

32、ose group .plus 50ol L glucos e group ;D :V an C-con a n ng seru (20 %)plus 50· 303 ·ve M ed c ne, M arch 20 , Vol .9 , No .3中西医结合学报 20年 3 月第 9 卷第3 期 Jou rnal o C hIn egra脉 ;久致阴损及阳 , 寒凝血滞, 气血不能通达四肢, 肌3 讨 论肉筋脉失于濡养。JM T 是协和医院院内制剂,DPN 是11 %的新最常见的慢性并发症之一, 超过主要由菟丝子 、女贞子 、水蛭、延胡索、桂枝、细辛等组成。菟丝子配伍女贞

33、子滋阴益肾, 阴阳俱补,患者DPN , 随着病程延长, 患病率可高达90 %以上 8 。DPN 的发病机制尚未完全阐明, 近年来众多学者认为高血糖导致细胞损伤最终都与氧化应激密切相关。2001 年 Brow nlee 9寓阴之意;配伍水蛭活血逐瘀 , 使补肾与活血并行, 祛邪而不伤正 ;桂枝、细辛振奋气血, 温通血脉 ;延胡索行气活血止痛。通脉之功效。共奏补肾活血、温经提出了并发症的统一机制学说, 认为高糖引起线粒体中ROS 生成过多, 将组织细胞中发生本实验用 JM T 和VC 含药血清干预 48 h 后测氧化应激, 最终导致的各种并发症。定SC 内NA DPH 氧化酶p22 phoxmRN

34、A 值ROS 是启动整个氧化应激反应的关键, ROS 的生成与 NADPH 氧化酶密切相关。 最早发现和iNOS 蛋白表达。结果显示, JM T 能明显降低高糖培养的 SC 内 p22 phox的 m RNA 及 iNOSNADPH 氧化酶于吞噬细胞中, 近年来发现其蛋白表达, 其作用优于 VC 。Olukm an 等 17 发现广泛吞噬细胞中。既往研究发现, 在糖尿NADPH 抑制剂 apocynin 能够降低大鼠病患者 10 和动物模型中 11 NADPH 氧化酶的 p22p22 phox 及iNOS 的蛋白及m RNA 表达, 推测可能与转录因子如 NF B 和激活蛋白因子 1 (act

35、iv ation protein 1 , A P 1)的作用有关, NF B 或 AP 1 可激活iNOS 和NA DPH 氧化酶的基因启动因子从而调节其表达。 另有学者观察到使用RAGE 激动剂 S100 可使背根神经节细胞中NADPH 氧化酶增加, 从而介导 ROS 生成, 导致细phox 、g p91 phox 、p47 pho x 、p67 pho x的蛋白和(或)m RNA 表达水平升高。其中p22 pho x是NADPH 氧化酶产生超氧阴离子的关键, 细胞内表达比较, 在近来病变的研究中颇受模型中 PKC 通NF B)和晚期糖基product , AGE)晚关注 12。研究证实在高

36、糖或路、核因子B (nuclear factor B ,化终产物(advanced glycation end胞损伤 1。使用AG E 体外孵育平滑肌细胞可期糖基化终产物受体(recepto r for AGE , RAGE)激活介导的NADPH 氧化酶生成增多在氧化应激过扮演重要角色 13 15 。NOS 主要有3 种形式 :内皮型(endothelial NOS , eNOS)、神 经元型 (neuronal使NADPH 氧化酶表达增加, 其产生的超氧阴离子可进一步激活 NF B , 从而介导 iNOS 的上调及与之伴随的过氧化亚硝酸盐的生成, 导致细胞损伤和功能蛋白的失活, 这一信号转导

37、通路可能为治疗提供新的靶点 15 。既往的临床及实验研究已经证实NOS , nNOS)和诱导型(iN OS)。iNO S 在引起的硝化应激和神经纤维功能及退变中起关键筋脉通能够减少大鼠坐骨神经中 AGE 的形作用。但目前研究结果尚不一致, 有学者证实iNOS及其介导的硝化应激产物硝基酪氨酸表达增加在降成及下调 RAGE 蛋白及 m RN A 的表达 18 ;降低NF B 的表达, 亦可有效抑制高糖培养 SC 中 NF B 蛋白及 m RNA 的表达, 并减轻氧化应激损伤。综上所述, 推测JM T 可能通过抑制AGE RAGE 及NF B 的激活所致的NADPH 氧化酶和iNOS 表达低大鼠神经

38、传导速度和导致小纤维感觉神经病变中起重要作用 2 。但有学者发现 DM 大鼠造模后 2及 1 年, 坐骨神经iNOS mRNA 的表达均明显下降, 而在腰背根神经节则未见明显变增加, 从而DPN 的作用。氧化应激和硝化应激, 以达到治疗化 16。本实验结果显示 :高糖组 p22 pho x的mRNA 值较正常对照组明显升高(P <0 .01), 这说明在转录水平上高糖刺激可使 SC 内 p22 phox 亚基的表达明显升高。另外, 高糖组 iNOS 的蛋白表达也较正常组明显升高(P <0 .01), 证实了高糖环境可使SC 内iNOS 蛋白表达增强。由此可见, 高糖刺激可使SC 中

39、 NADPH 氧化酶活性增强, ROS 生4致 谢感谢资助。市自然科学基金委员会为本项目提供REFERENCES成增多, ROS 与iNOS的 NO 作用形成过氧化Co ppey L J , G elle tt JS , D avidson EP , Y o rek M A .P reventing supero xide formation in epineurial ar te rio les of the sciatic nerve from diabetic rats restores endo thelium1亚硝酸盐, 氧化或硝化蛋白质 、核酸和脂肪等大分子物质, 导致细胞损伤。中

40、医认为 DPN 的主要病机是由于消渴日久, 肾阴受损 阴虚内热, 煎熬津液, 血黏成瘀, 阻滞筋dependent vasodilatio n.33 40 .Radic Res.2003 ;37(1):· 304 ·In egra ve M ed c ne , M arch 20 , Vol .9 , No .3中西医结合学报 20 年 3 月第 9 卷第 3 期Journal o ChVa reniuk I ,Pav lo v IA , O bro so va IG .Inducible nitricDG , Fo rstermann U , Munzel T .Mech

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