免疫细胞化学和免疫荧光

1、免疫细胞化学和免疫荧光般步骤：1. 将盖玻片表面用 PEI (聚亚乙基亚胺)或者 poly-L- 赖氨酸室温处理 1h。2. 盖玻片用无菌水清洗 3 次，每次 5 分钟。3. 盖玻片完全干燥后置于 UV 紫外下杀菌 4h 。4. 将细胞培养于处理的盖玻片上，或者准备细胞离心涂片。5. 用 PBS 简单清洗。6. 洗脱液我们推荐使用含 0.1%Tween20 的 PBS 溶液。固定细胞可以使用以下两个方法之一固定：1. 用置于 -20 °冷冻的 100%的甲醇室温处理孵育细胞 5 分钟。2. 使用 4% 的多聚甲醛 PBS 固定液( PH:7.40 )室温固定 10 分钟。细胞用预冷的

2、 PBS 清洗 3 次。抗原修复(可选步骤)在细胞受到热抗原修复后，一些抗体会更有效。一抗使用时可以查看产品说明书看是否 需要抗原修复这一步骤。1. 预热抗原修复液(100 mM Tris, 5% (w/v) urea, pH 9.5) )至95 °C:可以将盛有抗原修 复液的染色缸放于 95°C的水浴锅中。2. 使用一副宽头的镊子， 将盖玻片小心的置于盛有抗原修复液的染色缸中， 使细胞面朝上。3. 95°C加热盖玻片10分钟。4. 将盖玻片从抗原修复液中取出，细胞面朝上置于盛有 PBS 的 6 孔板中。5. 用 PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 分钟。透化(

3、Permeabilization )若目标蛋白位于细胞内，那么通透细胞就显得尤其的重要。丙醇固定的样品不需要通透。1. 将样品置于含 0.1-0.25% Triton X-100 或者 100 卩 M Digitonin or 0.5% Saponin 的 PBS 溶液中 10 分钟。 Triton X-100 是目前广泛使用的能够提高抗体的渗透能力的去垢剂。然而，这并不适用于位于膜上的抗原，因为它会损坏膜。对于每一种感兴趣的蛋白都要选择合适的 Triton X-100 的浓度。2. 用 PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 分钟。封闭和免疫染色1. 用含 1%BSA 的 PBST 、含 22.

4、52mg/ml 甘氨酸的 PBST （ PBS+ 0.1% Tween 20 ）封闭 细胞 30 分钟，阻断非特异性结合的抗体。也可以选择 1%明胶或者 10% 的血清（血清为生 产二抗时的免疫物种的血清）封闭，具体可以查看相关抗体说明书中的推荐的封闭方法。2.一抗孵育：用含1%BSA 的 PBST 稀释抗体，孵育时置于湿润的环境中室温处理1h 或者4°C过夜。3.去除一抗溶液，用PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。4.二抗孵育：用含1%BSA 的 PBST 稀释二抗，室温避光 1h。5.去除二抗溶液，用PBS 避光清洗 3 次，每次 5 分钟。多重免疫染色（可选步骤）为了检测在同

5、一样品中两种或两种以上不同抗原的分布情况，可以使用多重免疫荧光染 色的方法。 多重免疫荧光染色的方法可以通过同时染色 （两种抗体混合） 或者依次分别染色 来实现（一个染色后染另一个） 。首先要确保你有不同物种的一抗和相对应的二抗。例如，兔抗对应抗原A ，鼠抗对应抗原 B 。或者，你可以使用直接偶联不同荧光素的一抗。同时孵育：1. 用含 1%BSA 的 PBST 封闭细胞 30 分钟，阻断非特异性结合的抗体。也可以选择 1% 明胶或者 10% 的血清（血清为生产二抗时的免疫物种的血清）封闭。2. 一抗孵育：将两种一抗（如两种目标抗原都是人类蛋白，兔源一抗对应人的抗原-1 ，鼠源一抗对应人的抗原

6、-2）混合于含 1%BSA 的 PBST 中，孵育时置于湿润的环境中室温处理 1h或者4°C过夜。3. 去除混合的一抗溶液，用 PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。4. 二抗孵育：将两种来源于不同物种且带不同荧光素的二抗（例如：Texas- 红偶联的对应兔源的一抗， FITC 偶联的对应鼠源的一抗）混合于含 1%BSA 的 PBST 中，室温避光 1h。5. 去除混合的二抗溶液，用 PBS 避光清洗 3 次，每次 5 分钟。分步孵育：1. 第一次封闭：细胞用封闭液室温处理 30 分钟，阻断非特异性结合的抗体。封闭液可用1 0%的血清（血清为生产二抗时的免疫物种的血清） ，或者 1

7、%的明胶，也可用 1%的 BSA。2. 第一种一抗孵育：用含 1%BSA 或者含 1 %的血清的 PBST 稀释抗体，孵育时置于湿润 的环境中室温处理 1h或者4°C过夜。抗体孵育的条件取决于抗体的浓度和抗原在细胞 中的位置。3. 去除第一种一抗溶液，用 PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。4. 第一种二抗孵育： 用含 1%BSA 的 PBST 稀释二抗（用荧光素 -1 标记的），室温避光 1h。5. 去除第一种二抗溶液，用 PBS 避光清洗 3 次，每次 5 分钟。6. 第二次封闭： 细胞用封闭液室温处理 30 分钟，阻断非特异结合的抗体。 封闭液可用 10% 的血清（血清为生产

8、二抗时的免疫物种的血清） ，或者 1%的明胶，也可用 1%的 BSA 。7. 第二种一抗孵育：用含 1%BSA 或者含 1% 的血清的 PBST 稀释抗体，孵育时置于湿润 的环境中室温避光处理1h或者4°C过夜。抗体孵育的条件取决于抗体的浓度和抗原的位置。8. 去除第二种一抗溶液，用 PBS 避光清洗 3 次，每次 5 分钟。9. 第二种二抗孵育： 用含 1%BSA 的 PBST 稀释二抗（用荧光素 -2 标记的），室温避光 1h。10. 去除第二种二抗溶液，用 PBS 避光清洗 3 次，每次 5 分钟。 如果需要检测两种以上的抗原，其余的抗原均可继续使用 1-5 步骤来进行。对比染色1. 染核：用含 0.1-1ug