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1、定量PCRiii：反应优化-407，chenyd2004年1内容提要应用开发指南引物设计2应用开发指南定量PCR实验基本流程1.准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA)2.PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCR mix)3.填样品表(样品名、，样品类型、探针颜色)4.设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线)5.运行PCR，自动分析数据6.进一步分析数据 (基线、阈值、CT值、相对表达等)4应用开发指南Protocol for Quick Development ofUniversal TaqMan Gene Expression Assays使用Primer Express设

2、计引物和探针优化引物和探针的浓度Primers: 900 nM each；Probe: 250 nM each( generally, Primers: 300 nM each; Probe: 200 nM)证实系统只能检测cDNA 不能检测基因组DNAAssay Development Complete* 避免單管及小體積操作5应用开发指南探针设计指南赠送Primer Express68C - 70C65C - 67CTaqMan探针TmMGB探针Tm引物设计指南58C - 60C50-150 bp引物 Tm短PCR产物PCR程序指南通用的PCR条件2步法PCR：95C 15sec, 60C

3、 1 min实验条件快速优化指南所有实验在同样条件下完成固定的PCR试剂浓度2X TaqMan Universal PCR Master Mix只需简单优化引物/探针浓度6引物设计指南1.2.3.4.5.6.先设计探针，再设计引物；引物要尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠；G-C含量保持在30-80%之间；避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或的G；用Primer Express计算出来的Tm值应当在58-60 C之间；在引物3端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个。7Avoid the “GC clamp”Design rule: 5 nucleotides at the 3

4、end have only 1-2 G+Cs5primer3polymerisationtemplateTransient binding at 3 end of probeis quickly stabilised by the DNA polymerase8MGB探针设计指南1.2.探针的5 端第一个碱基不能是G；用Primer Express- 67C 之间；计算出来的MGB探针Tm值在653.4.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基；避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或的G；C比G多的探针效果更好，如果C少于G，则使用互补链；检测SNP或者基因突变，多态或突变位点尽量位于探

5、针，可以3个碱基并在倒数第二个碱基之前。5.6.9探针设计指南基因表达、cDNA定量研究，特别设计探针跨过两个外显子，增强反应特异性RQTaqMan探针3Exon 1Exon 2Exon 310探针的选择：C比G多的效果11正义链：3 C/11 G反义链：11 C / 3 GMGB探针设计指南SNP和基因突变位点在MGB探针中的位置DO NOT PLACE HEREpolymorphismNN N N N N N N N N N N NN NTry to position the polymorphism here (central third)If necessary, put the po

6、lymorphism here (region of MGB)12N N N NPCR程序指南13UNG激活Taq 激活UNG灭活2-步PCR引物浓度优化指南14引物浓度对PCR扩增效率的影响Nn15n 高浓度 /高效率n 高浓度 /低效率n 低浓度 /高效率N: 产物数量n: 循环数探针浓度优化指南Lowest Ct and highest delta Rn is better16PCR扩增效率的计算E = 10 -1/斜率17PCR效率对定量结果的影响n = 30E = 1.95N = N0(1.95)30 = N0 x 5.0 x 108相差2.2倍n = 30E = 1.90N = N

7、0(1.90)30 = N0 x 2.3 x 108N: number of amplified molecules N0:initial number of moleculesn: number of amplification cycles E: amplification efficiency18y = N0 (1+e)nIf you follow the Assay Optimization Guideline exactly, the PCR efficiency (e) could be approaching 100% !PCR效能可接近100%19DNA反应体系Componen

8、tsStock Conc.Add VolumeFinal Conc.DNAUniversal Master Mix Forward Primer Reverse Primer TaqMan ProbeH2O5251151310-100 ng1x50-900 nM50-900 nM50-250 nM2x45 uM45 uM2.5 uMTotal50 uL50 C 2 min 95 C 10 min (92 C 15 sec 60 C 1 min) x 40 循环反应总体积：96孔板25 - 50 uL；384孔板5 - 20 uL20cDNA反应体系反应总体积：96孔板25 - 50 uL；384孔板5 - 20 uL21cDNA (1-100 ng RNA反转录所得cDNA)12 x Universal PCR master mix1020 x Probe/Primer mix1H2O8Total20 uL50 C 2 min 95 C 10 min (92 C 15 sec 60 C 1 min) x 40 循环Primer Express22设计参数为Amelogenin X基因设计的一套引物和