端粒酶作为肿瘤标志物的研究进展

1、端粒酶作为肿瘤标志物的研究进展     长期以来，普遍认为癌症是由破坏细胞正常生长调节的多种基因突变引起。尽管不同的癌症可能涉及到一个特定的基因突变，个体的癌症往往表现为以多基因突变为特征。除了这种特殊的病因学外，最近的研究支持一种新的模式，即端粒酶的激活可能是许多恶性肿瘤发生的先决条件1。    1 端粒、端粒酶与细胞永生    端粒是真核细胞染色体末端的特殊DNA-蛋白质结构，其DNA的特殊是含有大量的（TTAGGG）n串联重复并富含G的重复序列，这些序列在进化中高度保守

2、。端粒结构功能主要有2个：一是可保护染色体基因组免受被降解或有害重组，其二是端粒重复可为染色体末端提供一种可消耗的非编码序列以暂时缓冲或取消末端复制问题所带来的染色体DNA进行性缩短。大多数普通体细胞的端粒会随周期性复制而逐渐缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止。说明端粒的缩短与高等真核生物中正常体细胞增生受到限制相关，在细胞衰老中扮演“分裂钟”的作用1。    与体细胞不同，生殖细胞要为将来产生新的有机体而保存基因组的全部信息。为此它们必须解决端粒缩短所引起的不良后果，方法是在染色体末端补充新的端粒重复序列。端粒酶就是行使这种功能

3、的DNA聚合酶，它是由RNA、蛋白质构成的核酸蛋白，可在体内以酶结构中的RNA成份（与端粒重复序列互补）为模板，在染色体末端催化添加TTAGGG重复序列。在生殖细胞中由于有端粒酶表达，其端粒不随年龄增长而缩短，故生殖细胞为永生细胞1。    由于端粒缩短和端粒酶无活性，体细胞通常逐渐衰老死亡。仅有极少数细胞偶然通过激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导致进行性肿瘤性发展2。在大多数癌细胞系和肿瘤细胞中端粒酶均有高水平表达3。表明端粒酶的激活表达与细胞的无限增殖有密切关系，通过解除细胞衰老过程中的增生受限，端粒酶的重新

4、活化可能是体细胞向肿瘤转化的关键步骤。    2 正常组织器官端粒酶表达    一些正常需要更新的组织表达低水平的端粒酶，其作用仅是部分补偿末端复制问题造成的端粒进行性缩短1。已发现有端粒酶表达的正常组织有外周血淋巴细胞、造血干细胞、生殖细胞、胚胎体细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等分裂旺盛的组织。正常外周血单个核细胞表达端粒酶的水平仅为无限增殖的癌细胞的1%2%4。Hiyama等5发现正常的肠道粘膜有端粒酶活性，他认为这种酶表达起源于肠道基底干细胞，但其水平比癌性粘膜低10倍100倍。尽管造血祖细胞和激活的淋巴细胞表达

5、很强的端粒酶活性，但端粒仍然逐渐缩短，提示在这些细胞是以一种与端粒长度无关的方式上调酶活性6。    由于组织样品通常是不同类型细胞的混合物，其中可能含有表达端粒酶的正常细胞，如果不了解由正常细胞产生的背景表达水平，就有可能将正常细胞的表达误判为肿瘤细胞的表达。    3 端粒酶作为肿瘤标志物早期诊断肿瘤    研究表明，大多数肿瘤组织细胞均有较高水平的端粒酶表达。而且在一些前侵袭性病变（如发育异常、原位癌）端粒酶表达的频率很高2，3，表明端粒酶激活是癌症多步骤形成过程中的早

6、期事件。常见恶性肿瘤端粒酶表达情形见附表。癌组织端粒酶表达有以下特点。    3.1 癌组织表达阳性率很高，除少数肿瘤外，阳性率均在80%以上。而癌旁组织和正常相应组织阳性率低于10%，为低水平表达。总体上，端粒酶表达与临床特征无明显关系，但与临床病理学特征有一定联系。一些研究表明端粒酶活性反映了细胞的恶变程度。例如SCLC的恶性程度高于NSCLC，故端粒酶的检出率和活性均高于NSCLC7。胃癌中端粒酶阳性肿瘤恶性程度较高8。前列腺癌组织中端粒酶活性相对水平与病理分化有关，高水平端粒酶活性在分化差的前列腺癌中更常见9。   

7、 3.3 在一些前侵袭性病变中端粒酶表达水平增加，如结肠肿瘤10、口腔原位癌和发育异常病灶1约半数表现端粒酶活性，尽管前侵袭病变并非都进展为癌，但其中端粒酶表达阳性者似乎可列为密切监控的对象。    3.4 迄今为止的资料提示端粒酶可预测脑膜 瘤、急性髓性白血病和胃肠道癌症的预后。Langford等12报道在端粒酶阳性的普通脑膜瘤患者中端粒酶活性与预后显著相关，这些形态学上良性的普通脑膜瘤中端粒酶的出现提示其中含有一群无限增殖细胞。在急性髓性白血病，端粒酶活性水平与特定的预后差的细胞遗传学特征（11q异常、染色体5和7缺失）相关13。 

8、;   由于端粒酶在大部分恶性肿瘤检出率很高，有可能用作癌症筛查的标志物。但是以侵入性方法获取肿瘤组织样品十分困难，非创伤性或微创伤性获取样品确定其端粒酶表达已受到积极关注。    kinoshita等14比较了一组膀胱癌肿瘤样品与随意尿、膀胱冲洗脱落细胞的端粒酶表达。肿瘤组织样品、膀胱冲洗液、随意尿中端粒酶检出率分别为98%（41/42）、84%（36/43）、55%（23/42）。而45例膀胱癌尿脱落细胞学仅42%检出癌细胞。无癌者的膀胱冲洗液未检出端粒酶。尿液和冲洗液脱落细胞端粒酶在I级癌检出率为75%（9/12），I

9、I级为96%（27/28），而细胞学检出癌细胞率I级为8%（1/12），II级为46%（13/28）。表明端粒酶检测癌症的敏感性显著高于细胞学检查，对膀胱癌的早期诊断和随访十分有用。    yoshita等5对有或无结肠癌的住院患者的结肠冲洗物检测端粒酶，其敏感性为60%（9/15），特异性为100%。在头颈部癌患者的口腔冲洗物中，端粒酶阳性率达32%（14/42），未发现口腔冲洗物阳性而癌组织是阴性的现象11。    作为微创伤性方法的细针穿刺在肿瘤的诊断取样中被常规采用。Hiyama等16在15例后来经术后标本

10、组织病理学确诊的乳腺癌的针吸标本中全部检出端粒酶表达。在有或无乳腺癌的患者中，细针抽吸样品端粒酶检测的诊断敏感性为67%，特异性90%17。Nouso等18用21G针活检取肝癌患者肝组织，端粒酶阳性率80%（8/10），与手术标本的端粒酶阳性率87%（20/23）无明显差异。说明细针活组织取样检测端粒酶可作为癌症早期检出的有力手段。    4 端粒酶测定方法    端粒酶由RNA和酶蛋白组成，其活性依赖于其RNA成分，用RNA酶处理后活性大部分丧失1。目前检测端粒酶表达有二种方法：一是以测其DNA聚合酶活性的端粒重

11、复扩增法（TRAP）；二是用RT-PCR测RNA组份。一些人认为人端粒酶RNA组份可能比酶本身更与前侵袭性侵袭性肿瘤相关，但目前组织细胞端粒酶检测仍是采用TRAP法为主。现将标准的TRAP分析步骤介绍如下3：（1）用特殊缓冲液裂解待检细胞制备出含端粒酶的抽提物；（2）用抽提物延伸引物TS（5-AATCCGTCGAGC aGAGTT-3）。由于端粒酶表现为步进活性（progressive activity），每延伸一个TTAGGG序列便终止，进入下一次延伸，因而产生了6bp差异的长度异质产物。（3）端粒酶反应产物用引物CX（5-CCCTTACCC tTACCCTTACCCTAA-3）进行PCR扩

12、增（9430、5030、7245，31个周期）。此步反应掺入-32P dCTP以便显示。（4）PCR产物用PAG分离，放射自显影显示。结果出现RNAse敏感的6bp梯子DNA带为端粒酶阳性。    附表 恶性肿瘤组织端粒酶活性    肿瘤部位或类型 正常良性组织    癌旁组织 肿瘤组织（%） 头颈扁平细胞癌 0/17正常组织 54/64（84.3） 肺 癌 3/68癌旁组织 109/136 (80.1) 肝 癌 4/46无癌肝组织 22/26 (85) 胃 癌 2/34癌旁

13、组织 58/66 (85) 贲门食管癌 0/8正常组织 9/9 胰 腺 癌 0/11良性瘤组织&nbs p;41/43 (95.3) 结 肠 癌 5/35对应正常组织 22/23 (95.6) 肾 癌 0/10正常组织 40/56 (71) 前列腺癌 0/10正常和良性增生    1/10癌旁良性增生 28/31 (90) 膀 胱 癌 0/17非病灶 41/42 (98) 妇科恶性肿瘤 37/39 (95) 血液肿瘤 14/16 (87) ALL 14/16 (87) AML 41/56 (73) 皮 肤 癌 1/10正常皮肤 91 黑色素瘤 5

14、/17良性黑痣 15/21 (71.4)    5 结 语    大量的研究已证实恶性肿瘤组织细胞中端粒酶活性增高与肿瘤发生发展密切相关，检测端粒酶活性用于恶性肿瘤早期诊断显示出诱人的前景。但有关端粒酶与肿瘤发生的过程有许多问题尚待阐明，如端粒酶是怎样激活的？同一种肿瘤为何有的表达有的则不表达端粒酶？无端粒酶表达的细胞是如何逃避衰老而成为无限增殖细胞？端粒酶、端粒酶RNA二者究竟谁最能真实反映端粒酶在肿瘤中的表达？端粒酶分析方法尚缺乏标准化等。    今后，应在常见恶性肿瘤中

15、进一步研究何种肿瘤是端粒酶诊断应用的最佳靶肿瘤，进行检测方法的标准化，发展端粒酶定量检测和原位检测方法，研究端粒酶表达在癌症监测、疗效和预后判断中的作用。    参考文献    1 Rhyu MS. JNCI, 1995;87:884-894    2 Breslow RA, Shay JW, Gazdar AF, et al. JNCI, 1997;89:618-623    3 kim NW, Piatyszek MA, Prows

16、e KR, et al. Science, 1994;266:2011-2015    4 Counter CM, Gupta J, harley CB, et al. Blood, 1995;85;2315-2320    5 hiyama E, Hiyama K, Tasumoto N, et al. Int J Oncol, 1996;9:453-458    6 norrback KF, Roose G. Eur J Cancer, 1997;33 PartA:774

17、    7 hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. JNCI, 1995;87:895    8 hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al, Cancer Res, 1995;55:3258    9 lin Y, J Urol, 1997;157:1161-1165    10 tahara H, Kuniyasu H, Yokozaki W, et al.

18、Clin Cancer Res, 1995;1:1245-1251    11Czlitano j, Ahrendt SA, Meiningor G, et al. Cancer Res, 1996;56:5720-5722    12 langford LA, Piatyszek MA, Xu R, et al. Human Pathol, 1997;28:416-420    13 zhang W, Piatyszek MA, Kobayashi T, et al. Clin Cancer Res, 1996;2:799-803    14 Kinoshita H. JNCI, 1997;89:724    15 yoshita K, Sugino T, Goodison S, et al. Br J Cancer