蛋白质分离纯化步骤

1、、蛋白质分离纯化得一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都就是与核酸等生物分子结合在一起 , 而且每种类型得 细胞都含有成千上万种不同得蛋白质。 许多蛋白质在结构、 性质上有许多相似之处， 所以蛋 白质得分离提纯就是一项复杂得工作。到目前为止 , 还没有一套现成得方法能把任何一种蛋 白质从复杂得混合物中提取出来。 但就是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适得分 离纯化程序以获得高纯度得制品。且分离得关键步骤、基本手段还就是共同得。? 蛋白质提纯得目得就是增加产品得纯度与产量 , 同时又要保持与提高产品得生 物活性。因此 , 要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目得蛋白质较丰富得材料。其 次,

2、 应设法避免蛋白质变性 ,以制备有活性得蛋白质。对于大多数蛋白质来说 , 纯化操作都就 是在 4得低温下进行得 . 同时也应避免过酸、过碱得条件以及剧烈得搅拌与振荡 . 另外, 还要设法除去变性得蛋白质与其它杂蛋白，从而达到增加纯度与提高产量得目得。二、分离纯化蛋白质得一般程序 分离纯化蛋白质得一般程序可分为以下几个步骤：（一 ） 材料得预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时 , 首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来得 天然状态， 不丧失活性。 所以要采用适当得方法将组织与细胞破碎 常用得破碎组织细胞得 方法有 :1?、 机械破碎法 ? 这种方法就是利用机械力得剪切作用 ,使细胞破碎

3、。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等 .2、 渗透破碎法这种方法就是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3、 反复冻融法生物组织经冻结后 , 细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。 这种方法简单方便 , 但要注意 那些对温度变化敏感得蛋白质不宜采用此法. 4?、 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5、 酶法? 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 ?（ 二） 蛋白质得抽提? 通常选择适当得缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。 抽提所用缓冲液得 H、离子强度、 组成成分等条件得选择应根据欲制备得蛋白质得性质而定。如膜蛋白得抽提 , 抽提缓冲液中 一般要加入表面活性剂 （十二烷基磺酸钠、 tri

4、 oX 00等） ，使膜结构破坏，利于蛋白 质与膜分离。在抽提过程中 , 应注意温度，避免剧烈搅拌等 ,以防止蛋白质得变性。 （三）蛋白质粗制品得获得选用适当得方法将所要得蛋白质与其它杂蛋白分离开来。 比较方便得有效方法就 是根据蛋白质溶解度得差异进行得分离 . 常用得有下列几种方法 :1、 等电点沉淀法不同蛋白质得等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2?、盐析法不同蛋白质盐析所需要得盐饱与度不同 , 所以可通过调节盐浓度将目得蛋白沉淀 析出。被盐析沉淀下来得蛋白质仍保持其天然性质 , 并能再度溶解而不变性。3、 有机溶剂沉淀法 ? 中性有机溶剂如乙醇、丙酮 , 它们得介电常数 比水

5、低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中得溶解度降低 ,进而从溶液中沉淀出来 , 因此可用 来沉淀蛋白质 . 此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面得水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而 析出.由于有机溶剂会使蛋白质变性 ,使用该法时 , 要注意在低温下操作 ,选择合适得有机溶 剂浓度。 ?( 四) 样品得进一步分离纯化 ? 用等电点沉淀法、盐析法所得到得蛋白质 一般含有其她蛋白质杂质， 须进一步分离提纯才能得到有一定纯度得样品。 常用得纯化方法 有：凝胶过滤层析、 离子交换纤维素层析、亲与层析等等。有时还需要这几种方法联合使用 才能得到较高纯度得蛋白质样品。1、 凝胶过滤层析 ? 凝胶过滤层析 (ge fi

6、ltration crmatography) 又称为分子排阻层析或分子筛层析。它就是将葡聚糖凝胶( h dx)装入一个柱子中，制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具有网状结构, 不同类型凝胶得网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时， 比凝胶网孔小得蛋白质可进入网孔内， 而大于网孔得 分子则不能进入被排阻在凝胶颗粒之外。当用洗脱液洗脱时 , 被排阻得分子量大得蛋白质直 接通过凝胶之间得缝隙先被洗脱下来 , 而比网孔小得蛋白质可连续不断地进入网孔内。这样 得小分子不但流经得路程长 , 而且受到来自凝胶内部得阻力也很大 , 所以蛋白质越小， 从柱子 上洗脱下来所需时间越长 . 由于不同蛋白质得分子大小不

7、同 ,进入网孔得程度不同 , 因此流出 得速度不同，洗脱所用体积及时间不同，从而达到分离得目得。 ? 、 纤维素柱 层析法该法就是利用蛋白质得酸碱性质作为分离得基础。离子交换纤维素( cellulose ion- xcha ger )就是人工合成得纤维素衍生物， 它具有松散得亲水性网状结构 , 有较大得 表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质得分离。(1 )羧甲基纤维素( C纤维素 )在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性pH条件下 , 羧甲基上得质子可解离下来（图 a），而溶液中带正电荷得蛋白质分子可与纤维素颗粒上得羧甲基负电荷结 合可交换得基团带正电， 因此就是一种阳离子交换剂

8、。 蛋白质与离子交换纤维素之间结合 能力得大小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。 2（?）二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）在中性 H条件下， 它含有带正电荷得基团 , 可与溶液中得带负电荷得蛋白质结合， 可交换得基团带负电荷 , 因此就是一种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有 DEAE-纤维素得层析柱时 , 带正电荷得蛋白质不能结合而随着洗脱液得流动先被洗脱下来。 带 负电荷得蛋白质将被结合到柱上 . 结合力取决于彼此相反电荷基团间得静电吸引。然后选用 一定 pH与离子强度得缓冲液进行洗脱 , 改变蛋白质分子所带得静电荷 ,依次从层析柱流出达 到相互分离得目得。3、 亲与层析

9、亲与层析 （af nt -c omaography） 分离技术就是根据许多蛋白质对 特定得化学基团具有专一性结合得原理。 这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合得 基团称为配基或配体（ ligand）. 亲与层析就是一种极有效得分离纯化蛋白质得方法. 例如酶对它得底物具有特殊得亲与力；抗原与抗体互为配基。以伴刀豆球蛋白A（co anavali ）得分离纯化为例， 由于该蛋白对葡萄糖有专一性亲与吸附, 因此可把葡萄糖通过适当得化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类得载体表面上. 为了防止载体表面得空间位阻影响待分离得蛋白质大分子与其配基得结合， 在配基与载体之间往往插入一段所谓得连接臂 （或称

10、 为间隔臂 ,space rm）, 使配体与载体之间保持足够得距离。 ? 将这种多糖颗粒装 入一定规格得玻璃管中就制成了一根亲与层析柱。 当含有伴刀豆球蛋白得提取液加到层析柱 得上部 ,并沿柱向下流过时 ,待纯化得蛋白质与其特异性配基结合而被吸附到柱上 , 其她蛋白 因不能与葡萄糖配基结合将通过柱子而流出（图 2- 8a ）。然后采用一定得洗脱条件 ,如浓得葡萄糖溶液进行洗脱 ,即可把该蛋白质洗脱下来 , 达到与其它蛋白质分离得目得 . 三、蛋白质分子量得测定 ? 蛋白质分子量测定得方法很多， 目前常用得方法有以下 几种。（一）凝胶过滤法 ?凝胶过滤法测定蛋白质分子量得原理如“分离纯化方法中所

11、, 在此范述。一定型号得凝胶颗粒上具有一定大小得孔隙， 只允许较小得分子进入胶粒， 而大于孔隙 得分子则不能进入胶粒而被排阻在胶粒外面。 用洗脱液洗脱时， 被排阻得分子量大得蛋白质 先被洗脱下来，随后能够进入颗粒得蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来 , 分子量越小 得越后被洗脱下来。由于不同排阻范围得葡聚糖凝胶有一特定得蛋白质分子量范围 围内， 分子量得对数与洗脱体积之间成线性关系。 因此， 用几种已知分子量得蛋白质为标准 进行层析分析， 以每种蛋白质得洗脱体积对它们得分子量得对数作图， 绘制出标准洗脱曲线 . 未知蛋白质在同样得条件下进行层析分析 , 根据其所用得洗脱体积 , 从标准洗脱曲

12、线上可求 出此未知蛋白质对应得分子量来。（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中得电泳速度取决于蛋白质分子大小、 所带电荷得 量以及分子形状。 而 SS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同得就是在样品及电泳缓冲液中加入 了十二烷基硫酸钠 （sod m dodecyl sulfate, DS）。 SDS就是一种阴离子去污剂，可使 蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS（一般加入量为 0、1%）后， SD与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量得负电荷 , 这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带得 电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间得电荷差异。所有结合SD得蛋白质 D

13、S复合物得形状近似于长得椭园棒 ,它们得短轴就是恒定得 ,而长轴与蛋白质分子量得大小成正比。 这样 , 消除了蛋白质之间原有得电荷与形状得差异 , 电泳得速度只取决于蛋白质分子量得大小。 ? 进行凝胶电泳时 , 常常用一种染料作前沿物质 , 蛋白质分子在电泳中得移动距离与 前沿物质移动得距离之比值称为相对迁移率， 相对迁移率与分子质量得对数成直线关系。 以 标准蛋白质分子质量得对数与其相对迁移率作图 , 得到标准曲线。将未知蛋白质在同样条件 下电泳 ,根据测得得样品相对迁移率 , 从标准曲线上便可查出其分子量。（三）沉降法 沉降法又称超速离心法。蛋白质溶液在受到强大得离心力作用时 , 蛋白质分

14、子趋 于下沉 , 沉降速度与蛋白质分子得大小、 密度与分子形状有关， 也与溶剂得密度与粘度有关。 蛋白质颗粒在离心场中得沉降速度用每单位时间内颗粒下沉得距离来表示。在离心场中， 蛋白质分子所受到得净离心力 （ 离心力减去浮力 ） 与溶剂得摩擦力平 衡时 , 每单位离心场强度得沉降速度称为沉降系数（Sedi entation oe ficien ）。国际上采用 Sveberg 单位作为沉降系数得单位 ,用 S表示,以纪念超速离心法得创始人， 瑞典 著名得蛋白质化学家 T、Svedb rg. 一个 Sv db rg 单位（或直接称一个 S）为 1 0 13s 。 蛋白质得沉降系数大约在 110 1

15、300 013s 范围内 , 即 1S 200S. 蛋白质分离纯化得一般程序可分为以下几个步骤 :? （ 一）材料得预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时 , 首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来得天然状态，不丧失活 性。所以要采用适当得方法将组织与细胞破碎。常用得破碎组织细胞得方法有 :?1、 机械破碎法这种方法就是利用机械力得剪切作用 , 使细胞破碎。常用设备有 , 高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。?、 渗透破碎法 ?这种方法就是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。?3、 反复冻融法生物组织经冻结后 ,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。 这种方法简单方便 , 但要注意那些对温度变化敏感 得蛋

16、白质不宜采用此法。 ?4、 超声波法 ?使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。?、 酶法?如用溶菌酶破坏微生物细胞等。? （ 二） 蛋白质得抽提 ?通常选择适当得缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液得pH、离子强度、组成成分等条件得选择应根据欲制备得蛋白质得性质而定。 如膜蛋白得抽提， 抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂 （ 十二烷基 磺酸钠、 tr tonX-1 等）, 使膜结构破坏 ,利于蛋白质与膜分离。 在抽提过程中 ,应注意温度 , 避免剧烈搅 拌等,以防止蛋白质得变性 .? （ 三）蛋白质粗制品得获得 ?选用适当得方法将所要得蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便得有效方法就是根据蛋白质溶解度得 差异进行得分离。常用得有下列几种方法 :?1、 等电点沉淀法 ?不同蛋白质得等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离 . ?2 、 盐析法不同蛋白质盐析所需要得盐饱与度不同 , 所以可通过调节盐浓度将目得蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来 得蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。? 3 、 有机溶剂沉淀法 ? 中性有机溶剂如乙醇、丙酮 ,它们得介电常数比水低 .