凉果食品微生物的检验方法

1、凉果食品微生物的检验方法食品在制造与食用前的各个环节中，都存在被微生物污染的可能，微生物检验就是评价食品被微生物污染程度的主要方法。微生物检验时，一般常采用细菌数量(主要是菌落总数)、大肠菌群最近似数(MPN)、致病菌作为评价污染程度的三项细菌指标。蜜饯卫生标准（GB148842003）中，规定了菌落总数、大肠菌群、致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄菌球）和霉菌等项微生物指标，如表1所示，其中菌落总数和大肠菌群是按蜜饯生产许可证审查细则规定、企业必须自检的项目。表1 凉果微生物指标项目指标菌落总数/(cfu/g)1000大肠菌群/(MPN/100g)30致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡

2、萄菌球）不得检出霉菌/(cfu/g)50（一）菌落总数的检验方法1菌落总数的概念食品中细菌数量越多，食品腐败变质的速度就越快，对消费者的健康危害也越大，如当食品中的细菌数量达到110105cfu/g时，就可能引起食用者食物中毒。菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖、形成能被肉眼识别的生长物，由数以万计相同的细菌集合而成。根据所采用计数方法的不同，细菌数量的表示方法分为菌落总数和细菌总数两种。（1）菌落总数指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。通常以lg或1mL或lcm2样品中所含的菌落数量来表示。检测菌落总数

3、的细菌培养，按国家标准方法规定：在需氧情况下、37培养48h，将能在普通营养琼脂平板上生长的细菌计为菌落总数。厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于此条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不能反映实际的所有细菌总数，且不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。（2） 细菌总数指一定数量或面积的食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数，通常以1g或1mL或lcm2样品中的细菌总数来表示。2菌落总数的常规检验方法菌落总数测定可用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，菌

4、落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣，是反映食品是否符合卫生要求的主要指标。食品卫生微生物学检验（GB47892-2003）中规定了菌落总数的常规检验方法。一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48h），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每毫升）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作步骤如图1所示。（1） 样品的处理和稀释 操作方法A以无菌操作取检样25g（或25mL)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)

5、或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成110的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理1min，制成110的均匀稀释液。B用1mL灭菌吸管吸取110稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1100的稀释液。做成几个适当倍数的稀释液选择23个适宜稀释度，各以1mL分别加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂菌落计数出具检测报告检 样361 482h培养图1 菌落总数常规检验基本操作步骤C另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。 无菌操作操

6、作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的（采用干热灭菌），所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15min，每个平板不得超过15个菌落。 采样的代表性如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 稀释液样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如咸话梅）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。（2

7、）倾注培养 操作方法A根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。B 将凉至4650营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。C 待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 倾注用培养基应在4650水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注

8、培养基的量规定不一，从1220mL不等，一般以15mL较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。 为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。 培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质

9、与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。（3）计数和报告 操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每mL）中的菌落数，进行报告。 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。 计数时应选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求

10、为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。 若所有稀释度均不在计数区间，如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之；如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本

11、接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料、含有防腐剂等），不应作为检样计数报告的依据。 当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计；如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数；如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用；如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释

12、倍数作为该平板的菌落数。 菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告；如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算；固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。3菌落总数的其它检验方法菌落总数的其它检验方法还有涂布平板法、点滴平板法、螺旋平板法。螺旋平板法是由一台机器完成的。（1）涂布平板法是将营养琼脂制成平板，在上面滴加检样稀释液0.2mL，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放置约10min，将平板翻转，放至361温箱内培养242h取出，进行菌落计数，然后乘以5(由0.2mL换算为1mL)，再乘以

13、样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样所含菌落数。涂布平板法比常规检验法效果好，因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆，但是该法取样量比常规检验法少，代表性会受到一定影响。（2）点滴平板法与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头，按滴(每滴相当于0.025mL)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域 (预先在乎板背面用标记笔划成四个区域)，每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平约10min，然后翻转平板，如涂布平板法+样移入温箱中，培养68h后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0.025mL换算

14、为1mL)，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。（二）大肠菌群MPN的检验1大肠菌群MPN的概念及意义大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面的特性并非完全一致。（1）概念大肠菌群系指一群在37能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。从种类上讲，大肠菌举包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等，以埃希氏菌属为主。大肠菌群MPN是指在100mL(或100g)食品检样中听含的大肠菌群的最

15、近似或最可能数；是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。（2）大肠菌群MPN的卫生学意义作为判断食品是否被肠道致病菌所污染及污染程度的指示菌，必须符合以下三个条件： 和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检出； 在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长； 检验方法比较简便。大量研究表明，大肠菌群在数量和检验方面均符合以上指示菌的三项要求。因此，用大肠菌群作为标志食品是否已被肠道致病菌污染或污染程度的指标菌是合适的，即在食品中存在的大肠菌群数量越多，表示该食品受粪便污染的程度越大，也就相应地表示该食品被肠道致病菌污染的可能性也就越大。大

16、肠菌群作为评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。2.大肠菌群MPN的常规检验方法大肠菌群MPN常规的检验方法有三管系列、五管系列和其它系列，其原理相同，区别在于样品滴度和各滴度的管数，三管系列接种三个滴度、每个滴度三管、五管系列接种五个滴度、每个滴度五管，以三管系列较为简便。国家标准(GB47893-2003)中大肠菌群MPN的检验方法是将不同倍数的检样稀释液接种到乳糖胆盐发酵管内，经一定的温度、时间发酵，若均不产气者则可报告为阴性；如有产气者，则需进行分离培养，证实试验，然后查取MPN检索表，报告出每100mL(g)大肠菌群的最近似数。大肠菌群MPN的检验程

17、序如图2所示。（1）检样稀释 以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成110的均匀稀释液。固体检样最好用匀质器。以800010000转分钟的速度处理1min，做成 110的均匀稀释液。 用1mL灭菌吸管吸取110稀轻液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作110的稀释液。 另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1支1mL灭菌吸管：检 样稀 释乳糖胆盐发酵管361，24h2h不产气产 气大肠菌群阴性伊红美蓝琼脂平

18、板361，24h2h报 告革兰氏染色乳糖发酵管361，24h2h革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌产 气不产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阴性报 告报 告报 告图2 大肠菌群MPN检验程序 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接 种3管。（2）乳糖发酵在乳糖发酵过程中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡，这些气泡是由于大肠菌群的产气而产生。大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气

19、泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，需作进一步试验。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置361温箱内，培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程序进行。（3）分离培养将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上，转接采用平板划线的方法。接种后的平板置361温箱内培养1824h，取出观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。典型大肠菌群的菌落为黑色带金属光泽或无光泽，红色和粉红色菌落也有一定可能性。为防止假阴性，挑选菌落时，应尽量挑取典型菌落，并

20、多挑几个菌落做证实试验。（4）证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养242h，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 （5）报告根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的最近似数(MPN)。大肠菌群MPN是对样品中活菌密度的估测。对于样品稀释度的选择，也是基于对产品中大肠菌群数的估测，较为理想的结果应是最低稀释度为阳性管，而最低稀释度为阴性。如果三个浓度均为阳性，建议重新选择稀释度数。查MPN表时，要注意稀释倍数的变换，将得出的数据乘以稀释倍数。当

21、检索表中三个稀释度检测结果均为阴性时，MPN值按照3判定。3大肠菌群MPN的其它检验方法大肠菌群MPN的其他测定方法有琉水网膜法、TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）显色法，DC(去氧胆酸钠)半固体法、纸片法等。（1）疏水网膜法疏水网膜法是1974年加拿大的Sharp AN博士等人首次撰文介绍的，该方法最初只能检验水中的大肠菌群和大肠杆菌，现在则几乎可检验所有食品中的细菌，如沙门氏菌等。（2）TTC显色法TTC显色法使用的是含有TTC(2、3、5一氯化三苯四氮唑)的乳糖发酵培养基，接种方法和MPN的三管法相同，接种后于361培养1824h。观察TTC乳糖培养基呈色和产气情况判定大肠菌群。按表2

22、标准进行判定。（3）DC(去氧胆酸钠)半固体试管法 选择三个稀释度的样品液，每个稀释度分别取1mL放入灭菌试管中。 将溶化并冷至50左右的DC半固体培养基加入上述试管中，每管3mL。立即混合)，凝固后于37培养1824h。 判定标准和记录a、培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记录为；b、培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为十；c、培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为；d、培养基为绿色，记录为。 判定为a、d反应结果记录阳性管数，查MPN表并报告之；若为b、c反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管数查MPN表，并报告之。（4）

23、纸片法采用商业化大肠菌群检测纸片，可以将原来几步的试验简化为一步，时间由一个星期左右缩短为十几个小时。 样品25g（或mL）放入含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的玻璃瓶（瓶内置适当数量的玻璃珠）内，经充分振摇做成110的均匀释释液，用1mL灭菌吸管吸取110稀释液，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管做成1：100的稀释液，以此类推，每次换一支吸管。 选两个稀释度进行检测，一般情况下，饮料和饮用水采用原液和110两个稀释度，其他食品采用110和1100这两个稀释度。本品每份由三片大纸片（二片重叠放在一个袋中算作一片）和六片小纸片组成，用10mL灭菌吸管吸取10mL原液

24、或第一个稀释度的稀释液加到含有大纸片的塑料袋中，吸透后平放，做三个重复，再用1mL灭菌吸管吸取1mL同一稀释度的稀释液涂布到含有小纸片的塑料袋中，做三个重复。然后再取一支1mL灭菌吸管吸取1mL第二个稀释度的稀释液涂布到含有小纸片的塑料袋中，做三个重复。表2 大肠菌群最可能数(MPN)检索表阳性管数MPN 100 mL(g)95%可信限1 mL(g)x30.1mL(g) x 30.01mL(g)x3下限上限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160-00003333012390130160190-

25、1111000001234070110150=240003607101500130002400048000注1：本表采用3个稀释度1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)，每稀释度3管。注2：表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)时，表内数字相应降低10倍；如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。 将接种好的纸片袋口朝上，放入3537C培养箱中培养24h时，若纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为大肠菌群阳性纸片，纸片保持紫兰色不变或在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄色均为大

26、肠菌群阴性纸片，记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表(GB4789.3)查出相应的大肠菌群数。如接种的第一个稀释度的稀释液为原液，应将表上查出的结果除以10，以此类推。注：如果样品的酸碱度在pH7以下，应先用灭菌的Na2CO3溶液调整到pH78，否则接种后纸片马上变黄。保存条件：商业化大肠菌群检测纸片需存在10以下冰箱中，未开封的保质期为一年；铝箔袋打开后，未用的纸片要放回铝箔袋中重新封好，放到冰箱中，一个月内用完。（三）霉菌的检测方法1.霉菌介绍霉菌是真菌中的一大类，一般为单细胞，呈圆形，卵圆形、腊肠形或杆状，通常将能够形成疏松绒毛状菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌广泛分布于自

27、然界，并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌加工一些食品，如加工干酪、制酱等；在化学、医药等工业也少不了霉菌。但另一方面，霉菌也是造成食品腐败变质的微生物之一，在一些不适于细菌生长的条件下，霉菌也可能在食品中出现，如pH较低、含盐和含糖高的食品（腌菜、凉果、蜜饯、糕点等），即使是在低温、湿度较低的贮藏环境下，经过一段时间，霉菌仍可能生长繁殖。霉菌导致食品的变质往往使食品失去其应有的色、香、味；有些霉菌在代谢过程中，还能够合成有毒代谢产物霉菌毒素，或转换某些不利于细菌的物质而促进致病细菌的生长，使食品存在安全问题。因此霉菌也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌计数来制定食品

28、被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌限量标准，我国已制订了一些食品中霉菌的限量标准。2.霉菌的检验方法霉菌的计数方法与菌落总数的测定方法基本相似，即将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。具体检测标准参见中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物检验 霉菌和酵母计数（GB4789.15-2003）。主要操作步骤为：（1） 采样及样品处理为了准确测定霉菌数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。（2） 稀释 以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为110稀释液。 用灭菌吸管吸取110稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。 取1mL110稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为