基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究Ⅰ.变形链球菌pac基因上游区序列测定和分析 -口

1、基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究.变形链球菌pac基因上游区序列测定和分析 -口凌均陈罕 摘要目的:对变形链球菌表面蛋白pac基因上游区进行序列测定和分析。方法:通过应用PCR测序试剂盒和DNA自动测序仪ABI310对变形链球菌表面蛋白pac基因上游区进行序列测定。结果:测定了pac基因上游区内的517个碱基序列。结论:变形链球菌表面蛋白pac基因上游区序列测定为基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究提供了基础资料。 关键词变形链球菌DNA序列测定pac基因 Recombinant Salmonella typhimurium Anticaries Vaccine .Sequence of

2、Streptococcus mutans Surface Protein pac Genes Upstream Ling Junqi, Chen Han College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences AbstractObjective:To sequence the Streptococcus mutans surface protein pac genes upstream. Methods: The PCR autosequence kit and autosequence instrument ABI

3、310 were used for sequence. Results: The 517 base pairs sequence of the pac genes upstream is sequenced. Conclusion: The sequence of pac genes upstream will provide useful information to construct the recombinant Salmonella typhimurium anticaries vaccine. Key words:Streptococcus mutansDNA sequencepa

4、c gene 龋病是一种细菌感染性疾病,变形链球菌与人类龋病密切相关。目前认为免疫学预防措施是控制龋病的手段之一1,并已研究了一系列防龋疫苗,如灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因工程重组疫苗等。目前存在的问题是,大多数疫苗由非肠道途径应用并引起血清IgG反应,而大多数病源微生物都是通过粘膜屏障而致病。因此,研究替代性接种途径以诱导保护性粘膜免疫应答是非常必要的2。本研究旨在运用分子生物学和遗传工程技术,制备带有变形链球菌表面蛋白的抗原结构基因的重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗,进行实验动物口腔人工自动免疫。本文将报告变形链球菌MT8148表面蛋白pac基因的上游区序列测定和分析,以进一步获得变

5、形链球菌表面蛋白的结构基因资料。 1材料和方法 1.1菌种与培养 E.coli MC1061(含质粒pPC41,日本福冈大学Koga教授赠送)。取-70保存的菌种划线于LB-Amp平皿上,37培养过夜。挑取单菌落于5 ml LB-Amp液体培养管中,37摇床培养8 h。取0.5 ml培养物接种于LB-Amp液体培养基中,37摇床培养1216 h(OD660=1.01.5)。4下,3000 r/min离心收集菌体。 1.2Qiagen plasmid kit提取和纯化质粒pPC41 采用Qiagen plasmid kit(Qiagen公司)试剂盒提取和纯化质粒。将已收集的菌体重悬于缓冲液 P1

6、(含10 mg/ml Rnase A)。加入缓冲液 P2,轻柔混匀,室温放置5 min,加入缓冲液 P3,轻柔充分混匀,冰浴20 min,4下,20000 r/min离心15 min,将上清移入一灭菌试管中。将Qiagen Tip 100柱用缓冲液 QBT 4 ml平衡,并依靠重力将缓冲液 QBT排尽。将离心获得的上清加样于柱中,依靠重力将上清过柱。加入缓冲液 QC 10 ml洗柱两次。加入5 ml 缓冲液 QF溶解洗脱柱中吸附的质粒DNA。将洗脱液加3.5 ml异丙醇充分混匀,4,15000 r/min离心30 min,去除上清,2 ml 70%乙醇洗涤沉淀,室温放置至乙醇完全挥发后,用0.

7、5 ml双蒸馏水溶解沉淀,-20保存。 1.3核苷酸序列测定 以M13/pUC测序通用引物5GTAAAACGACGGCC AGT3(上海生工公司合成),结合纯化质粒pPC41为模板,用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒,在PE公司6400型PCR仪上进行测序反应,模板用量约1 mg,引用物6 pmol。反应产物经纯化后用ABI公司310 DNA序列分析仪进行序列测定。 2结果 应用Qiagen plasmid kit获得了适用于测序的高纯度pPC41质粒DNA。 应用通用引物对pPC41质粒中的插入片段进行了测序,共测517个碱基对(图1)。 3讨论 龋病是一种细菌感染性疾病。预防微生

8、物引起的传染病的一个重要生理基础是粘膜免疫系统。分泌型IgA(SIgA)是粘膜免疫应答中最重要的因素。SIgA能有效地防止微生物在粘膜表面定居和对宿主细胞的侵袭。在肠道,微生物首先与肠道相关的淋巴组织(GALT)作用,刺激产生IgA的前体B细胞,这些前体细胞转移至肠系淋巴结、胸导管,然后通过体液循环分布到体内各个分泌组织,包括肠道和呼吸道的固有层,分化为成熟的浆细胞,分泌抗原特异性SIgA。非肠道途径使用疫苗不能有效地激发粘膜SIgA应答,所以对只定居在粘膜表面而不侵袭到深层组织的微生物免疫效果不佳。口服疫苗,尤其是减毒的口服活疫苗,因为能携带抗原至GALT,已证实能有效地激发特异性的SIgA

9、应答。 CNA NGC TTG CAT GCN TGC AGT AAC TGC NAC TNG ATA CTA AAA ATT CAA ATC CAC AAG TCA ATG TTG AAA CTN GAC TCA AGT GAA AAA GAC GAA AAT AAA ATG GTC ACC TCG GCT CCA GCT AAG GAG ACT GAG GCA GAA CAA AAT GAG AAA GCG GTA GCA GAA AAT CTT ATG CAA AGA CAA GCT AAG GCT GTC TCA ATT CCA TCG CAA GGC AAT TAT GTT TTC

10、CAA GAA ACA ACT CCT GTA AAA AAT GCA GCC AGT ATG TCC AGC CCA ACC CAA TTT AAC TTT GAT AAA GGA GAT AAG GTT TTT TAT GAT AAG GTT TTA GAA GCG GAT GGG CAT CAA TGG ATT AGC TAT GTG TCT TAC AGT GGT ATT CGT CGC TAT GAT CCT ATT GCT GTG ACA ATT GAA GAA TTG AAG CAA AAA GAA ATT GTT CAG CAA AAT TTA CCG GCA CAA GGA

11、ACC TAT CAC TTT ACT AAA CAA GCA AAC NTT AAA ATG ANC TAA CTG TCT ATT CCA CCA ATC TCG TTT ACA ACG GAA TCC GTT TTT ATA TAG GTT AAA ACC GAT GGC TCA TGA TAC TTT TTC TCC GTG TAC GTC TAN TTT ATG AAC TAC ACC ACC CTC ATN ACA NTT CGT CAT TCT CAA TAA GTC CAT CAT TTC TCA TCC CCN CGG TAA AGT TAT CTT GCA CAN NGN

12、ATT GTC CCA CGA GTA GGC NGT NAA AGT TTC TTT GTN AAA GNA GCC AAT TCA GTT CCA NTG GGC GGG GTT TNA CGG GNN AAN NNT T 图1pPC41质粒中插入片段的碱基对序列 减毒鼠伤寒沙门氏菌可以作为抗原载体,携带异源性抗原决定簇的质粒制成疫苗进行口服免疫。现代DNA重组技术已可能构建具有定向缺失特征的菌株,可采用缺失一个基因或基因群使细胞丧失它的部分或全部毒性,这种缺失在遗传学上一般是稳定的。Curtiss等构建鼠伤寒沙门氏菌cya、crp缺失突变株,证实这种突变株通过口服途径能引起高水平的保护性

13、免疫反应并显示高度减毒。鼠伤寒沙门氏菌能侵袭与肠道相关的淋巴组织,并在其中繁殖,从而有效地激发抗体和全身特异性的SIgA应答。利用遗传工程的技术可以将亲缘较远的原核生物或寄生虫等更高级生物的抗原基因引入沙门氏菌。Poirier等3将携带化脓性链球菌M5蛋白基因的质粒转化鼠伤寒沙门氏菌aroA突变型菌株获得成功。这种菌株免疫小鼠能引起对M5蛋白的血清和粘膜抗体反应。Sadoff等4将原虫的小孢子CS蛋白基因引入无毒的沙门氏菌,免疫小鼠5周后,小鼠体内产生特异性抗疟原虫的细胞应答。Doggett5克隆了远缘链球菌(S.sobrinus)SpaA抗原0.48 kb的基因片段至鼠伤寒沙门氏菌,免疫BA

14、LB/c鼠后,在小鼠唾液中测出抗SpaA IgA的效价。目前的研究提示,沙门氏菌作为疫苗载体的应用可能对细菌等病源体产生较广泛的保护性免疫。本研究将应用基因工程技术获得变形链球菌表面蛋白的结构基因,克隆至减毒鼠伤寒沙门氏菌,构建基因重组防龋疫苗。主要致龋细菌-变形链球菌的细胞表面蛋白具有高度的免疫原性,蛋白抗原PAc的结构基因pac克隆至埃希氏大肠杆菌MC1601(含pPC41),表面质粒pPC41由变形链球菌MT8148染色体PstI酶切片段通过T4DNA连接酶与经PstI、小牛肠碱性磷酸处理的pUC118连接构成6。获得目的基因是进行基因克隆,制备基因重组防龋疫苗的第一步。为了解所获得的p

15、PC41中pac基因的构成情况,本研究应用M13/pUC测序通用引物5GTAAAACGACGGCCAGT3,结合纯化后的质粒pPC41为模板,采用四标记单泳道法,通过DNA自动测序仪对pac基因上游区进行序列测定。DNA序列分析技术是一个包括DNA样品制备及碱基分析、信息处理的多阶段过程。本研究所用自动测序仪将凝胶电泳、初始信息收集、碱基阅读等步骤自动化,保证了测序反应可连续、高速地进行。用标记单泳道法将4种不同荧光标记物分别标记4个反应的引物,4个反应分开进行,产物合并在一个泳道中电泳分离。每个反应的产物可由特定的荧光标记加以区分,使DNA的顺序由通过检测阅荧光条带的顺序确定。Okahash

16、i等6,7分别完成了变形链球菌表面蛋白pac基因的克隆和测序工作。通过pac基因的序列分析,可以促进对表面蛋白的生物学特征及在龋病病因学中作用的了解。pPC41包括pac基因及其上游区,对pac基因上游区进行测序,有助于全面掌握pac基因的结构。本研究完成了pac基因上游区全部核苷酸顺序测定,为今后进一步进行基因重组、pac基因亚克隆提供了实验依据。 本课题由广东省自然科学基金资助(编号 970105) 作者单位:510060中山医科大学口腔医学院 参考文献 1 Lehner T. Immunology of dental caries. In: Immunology of Oral Dise

17、ase. 3rd ed, Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1992:68101 2 Redman TK, Cecily CH, Lallone RL, et al. Oral Immunization with Salmonella typhimurium, expressing surface protein Antigen A of Streptococcus sobrinus: dose response and induction of protective humoral response in rats. Infect Immu

18、ne, 1995, 63(8):20042011 3 Poirier TP, Kehon MA, Beachey EH. Protective immunity by oral administration of attenuated aroA Salmonella typhimurium expressing cloned streptococcal M protein. J Exp Med, 1998, 168(1):2532 4 Sadoff JC, Ballou WR, Baron LS, et al. Oral Salmonella typhimurium vaccine expressing circumsporozotie protein