复方鲜竹沥液微生物限度检查法的方法学研究试验资料

1、脑心舒口服液微生物限度检查法的方法学研究实验资料1目的 对供试品进行微生物限度检查时，确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法是否适合于该药品的微生物限度检查。本试验依据中国药典2010年版一部附录 C对其进行了微生物限度检查法的研究并验证，建立了该品种的微生物限度检查的方法。2样品：脑心舒口服液 批 号：规格： 生产单位： 3实验仪器：高压蒸汽立式灭菌器LMQ.C 山东新华医疗器械公司微波炉 SANYO EM-311EB1 合肥荣事达三洋电器股份有限公司电子天平 Sartorius BP2114 北京赛多利斯仪器系统有限公司净化工作台 JB-CJ-2FQ 苏州佳宝净化工程设备有

2、限公司生物安全柜 BHC-1300 A2 苏州安泰空气技术有限公司细菌培养箱 DG-1 上海医疗器械修理厂霉菌培养箱 MJX-250C 上海博迅实业有限公司医疗设备厂集菌仪 HTY-2000B 杭州高德医疗器械有限公司一次性使用薄膜过滤器4培养基胆盐乳糖发酵培养基 批号：20091018胆盐乳糖培养基 批号：20090908玫瑰红钠琼脂培养基 批号：20090405营养琼脂培养基 批号：090315营养肉汤培养基 批号：091012改良马丁液体培养基 批号：090608改良马丁琼脂培养基 批号：091006曙红亚甲蓝琼脂培养基批号：0810015菌种枯草杆菌 (Bacillus subtili

3、s) CMCC(B)63501金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 44102白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98001黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F)980036菌液制备6.1取上述经35培养1824小时的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜营养肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5 10-7，约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。6.2取经25 培养1824小时的白色念珠菌改

4、良马丁液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5 10-6，约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。6.3取经25 培养1周的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加5ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1 ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。7细菌计数法：7.1供试液制备 取供试品原液作为供试液。 7.2回收率测定：培养基稀释法（1）试验组：取供试液1 ml等量分注2个平皿中，同时加入50100c

5、fu 试验菌，立即倾注营养琼脂培养基，置3035培养箱培养2472小时逐日观察结果。（2）菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数。（3）供试品对照组：取供试液1 ml等量分注2个平皿中，立即倾注营养琼脂，置3035培养箱培养2472小时逐日观察结果，测定供试品本底菌数。（4）回收率的计算：按如下公式计算试验组的加菌回收率： 为该株阳性菌的回收率。结果见表1。8 霉菌、酵母菌计数法 ：8.1 供试液的制备：取供试品原液作为供试液。 8.2 回收率的测定：平皿法（1）试验组：取供试液1 ml和50100cfu 试验菌同时加入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置2328培养箱培养2472小时

6、，逐日观察结果。（2）菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数。（3）供试品对照组：取供试液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2472小时逐日观察结果，测定供试品本底菌数。（4）回收率的计算 按如下公式计算试验组的加菌回收率： 为该株阳性菌的回收率。结果见表1。表1 细菌、霉菌和酵母菌计数方法学验证的试验结果方法供试液浓度阳性菌代数菌液组（CFU）试验组（CFU）供试品对照组（CFU）回收率（%）培养基稀释法（0.5ml/皿）原液大肠埃希菌 2104105100108 0，0100%枯草芽孢杆菌 260594645 0，076%金黄色葡萄球菌 21089791109 0

7、，098%平皿法白色念珠菌 276767472 0，096%黑曲霉 288889191 0，0103%培养基稀释法（0.5ml/皿）原液大肠埃希菌 295949595 0，0101%枯草芽孢杆菌 261665656 0，088%金黄色葡萄球菌 246414445 0，0102%平皿法白色念珠菌 248513940 0，080%黑曲霉 277777175 0，095%培养基稀释法（0.5ml/皿）原液大肠埃希菌 288918095 0，098%枯草芽孢杆菌 249504640 0，087%金黄色葡萄球菌 2115116114109 0，097%平皿法白色念珠菌 250494241 0，084%黑

8、曲霉 2868191920，0110%9控制菌检查方法：大肠埃希菌检查法：供试液的制备：取供试品原液作为供试液。试验组：取供试液1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠埃希菌液10100cfu，置35培养24小时，取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液，观察。同时取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基，培养1824小时，观察结果。阴性菌对照组：取供试液1ml加入100ml胆盐乳糖培养基，同时加入上述金黄色葡萄球菌10100cfu，置35培养箱培养24小时，以下步骤同试验组，结果见表2 。表2 控制菌检查法方法学验证试验结果大肠埃希菌检查试验组（供试液+大肠埃希菌）阴性菌对照组（供试液+金黄色葡萄球菌）BL培养基 + MUG 靛基质试验 + + EMB平板 典型菌落生长 无菌落生长加入菌数（cfu） 54,58 55,6010结论经过试验验证，脑心舒口服液微生物限度检查法可采用以下方法：10.1 细菌计数法：培养基稀释法(取混匀的原液2ml，每ml等量分注2个平皿) 取供试品原液作为供试液，采用培养基稀释法，取上述供试液2ml，每1ml供试液等量分注2个平皿，依法测定。