马尾松毛虫种群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的异质性_图文

1、26(2138-142中国生物防治Chinese Journal of Biological C ontrol2010年5月马尾松毛虫种群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的异质性刘玉军,陈名君,汤强,王滨,黄勃,李增智3(安徽农业大学微生物防治省重点试验室,合肥230036摘要:2006年在皖东明光市紫阳林场,马尾松毛虫Dendrolimus punctatus种群中发生由球孢白僵菌Beauveria bassiana引起的流行病。本研究通过4对引物,对采自流行区的44株球孢白僵菌进行28S rDNA型内含子分析,以探讨流行菌株的遗传多样性及遗传类型。结果显示,存在8种不同内含子单倍型。各单倍型所

2、占比例不同,其中BABA型占据优势地位,为79155%; BC BC和BC BA型次之,皆为4154%;而BAAA等5种单倍型仅各占2127%。表明引起自然流行病的球孢白僵菌是一个异质性的群体。从生态适应性的角度出发,在球孢白僵菌种群中占据主导地位的BABA型菌株,今后可以作为明光地区生防菌株的重点筛选对象。关键词:马尾松毛虫;球孢白僵菌;分子标记;流行菌株;基因型;异质性中图分类号:S476112文献标识码:A文章编号:100529261(2010022*H eterogeneity of the Prevailing Strains of Beauveria bassiana in a P

3、opulationof the Massons Pine C aterpillar,Dendrolimus punctatusLI U Y u2jun,CHE N Ming2jun,T ANG Qiang,W ANG Bin,H UANG Bo,LI Z eng2zhi3 (Anhui Provincial K ey Laboratory for M icrobial C ontrol,Anhui Agricultural University,Hefei230036,ChinaAbstract:T o study the genotype and genetic diversity of t

4、he prevailing strains,a28S rDNA intron mark2 er2based genetic analysis was performed on44fungal strains representing the prevailing strains of Beauve2 ria bassiana on Dendrolimus punctatus in Mingguang.A diversity of8halpotypes appeared in the fungal population.Am ong them,the genotype BABA dominate

5、d the fungal population at a frequency of 79155%,and the genotypes BC BC and BC BA followed by4154%,whereas other5genotypes such as BAAA only occupied a percentage of2127%for each.The different genotype frequency indicated that the strains of B.bassiana with different genetic background had differen

6、t genetic stability and ecological adaptability.C onsideration of ecological adaptability,those strains with a genotype of BABA may serve as a key biological control agent for D.punctatus in Mingguang.K ey w ords:Dendrolimus punctatus;Beauveria bassiana;m olecular marker;prevailing strain;收稿日期:20092

7、05225基金项目:国家自然科学基金项目(30972368;教育部高等学校博士点专项科研基金(200503644001;安徽高校省级自然科学研究重点项目(T D200708;安徽省自然科学基金项目(070411012作者简介:刘玉军(1981-,男,硕士;3通讯作者,E2mail:zzli。831第2期刘玉军等:马尾松毛虫种群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的异质性genotype;heterogeneity球孢白僵菌Beauveria bassiana(Bals.2CrivVuill.可侵染15目700余种昆虫及其部分蜱螨类1,是自然界昆虫种群的重要限制因子。在我国南方,球孢白僵菌作为持续控制马

8、尾松毛虫(Dendrolimus punctatus的手段被广泛使用,在条件适宜时常可诱发松毛虫的流行病,从而取得良好的控制效果2。球孢白僵菌不仅有较强的寄生性,而且也具很强的腐生能力,因此能在一些自然环境中宿存下去。在土壤中,白僵菌在寄主种群中维持地方病的状态,并在寄主种群上升且环境条件适宜时上升成为大规模的流行病3。这种偶尔发生的自然流行病虽时有观察,但迄今鲜见报道。已有文献报道,松林生态系中的球孢白僵菌种群具有高度的异质性4,5。然而,这些研究所涉及的菌株虽然来自同一林分,但涉及不同时期的不同寄主;也就是说,多为引起不同寄主地方病的菌株。关于昆虫流行病所涉及到株系的遗传多样性,不管在哪类

9、昆虫病原物中目前尚无报道。了解不同遗传基础流行菌株的遗传结构,以及它们对环境的适应性、毒力及寄主谱等方面的差异,了解其在自然界中的延续能力及引起昆虫流行病的潜力,对于制定合理的治理决策具有重要意义。各种分子标记为昆虫的真菌流行病鉴定提供了良好的手段。RF LP、RAPD、AF LP等技术已被广泛应用于虫生真菌的遗传多样性研究610。28S rDNA型内含子标记技术由于操作简便、特异性强、重复性好和菌株易分类等优点,近年来已成为虫生真菌遗传多样性与分子生态学研究的主要手段之一5,1115。Neuvglise等15首先证明了布氏白僵菌(B.brongniartii的28S rDNA D11区域存在

10、内含子,利用配对引物扩增,可检测该区域内含子的有无及其类型。王成树16对28S rDNA I型内含子在球孢白僵菌分子生态学研究中的应用做了较系统研究,证明球孢白僵菌的28S rDNA D82D11区域存在4种不同的内含子。本研究通过28S rDNA I型内含子分析,研究马尾松毛虫球孢白僵菌自然流行病所涉及菌株的遗传多样性和遗传结构,探讨球孢白僵菌流行菌株与其遗传类型的关系。现将研究结果报道如下。1材料与方法111试验地概况与菌株采集2006年4月在安徽省明光市紫阳林场的马尾松毛虫种群中暴发由球孢白僵菌引起的大规模自然流行病,造成松毛虫种群的崩溃17。紫阳林场位于安徽省东北部明光市西北23km

11、处,居江淮分水岭北侧,地处东经117至119、北纬32至34之间,属北亚热带向暖温带过渡的半湿润季风气候。年平均气温15,全年无霜期219d,年平均降雨量93411mm。全场总面积2700hm2,有林地1870hm2,其主要树种为马尾松(Pinus massoniana。2006年6月20-22日在流行病的中心区域采集感病的马尾松毛虫虫尸标本,经分离、纯化及形态鉴定后,共获得44株球孢白僵菌菌株,保存于安徽省微生物防治重点试验室。112菌株培养与DNA提取在S DAY平板培养基上铺灭菌玻璃纸,平衡1d后取各菌株孢悬液012ml铺平板。251下培养6d,于玻璃纸上剥离菌丝体,冷冻干燥后备用。采用

12、氯化苄法提取DNA18。113PCR扩增与核型鉴定使用王成树16设计的4组引物E23/E24、121/122、131/132和129/138(表1对4个插入位931点进行扩增。PCR 反应体系与参数参照刘玉军等13,采用25l 反应体系:加有215l 10Taq酶缓冲液(Sag on 公司,200m ol/L dNTP (Promega 公司,115mm ol/L MgCl 2,0112ng 引物,110UTaq 聚合酶及50ng 的模板DNA 。扩增反应在M J Research 200型号的PCR 仪上进行。循环参数:954min ;9445s ,5745s ,7245s ,35个循环;7

13、2延伸10min 。取PCR 产物5l 经115%琼脂糖凝胶电泳检测,在IS 22200型紫外检测仪(Alpha Innotech 公司下观察和拍照。表1用于PCR 扩增的引物及其序列T able 1Sequences of 4p airs of primers for PCR amplification引物Primers序列(523Sequence 引物Primers序列(523Sequence E23CCG AACCAG AATTCGG T AAG CG I31ATCGG CTTGG CAG AATCAG CG E24G CTG AATT ACCATTG CGG ACAGG I32CAG

14、CCAAACTCCCCACCTG A I21CG ATCCTTT AG TCCCTCG AC I29CTG CCCAG TG CTCTG AATG TC I22CG CTT ACCG AATTCTG CTTCGGI38CG CTG ATTG TG CCAAG CCCAT2结果与分析211菌株的内含子扩增图谱不同菌株由于内含子的有无,经特异PCR扩增,可以得到分子量大小不同的DNA 扩增片段。其中具内含子的较大扩增片段定为A 型,不具内含子的扩增片段定为B 型。同时,由于球孢白僵菌的不同菌株间存在的准性生殖现象,导致某一菌株中可能存在异核现象,由此就可能得到大小不同的两条扩增片段,这种内含子的扩

15、增片段定为C 型16。通过4对引物对内含子的4个不同插入位点进行扩增,得到了清晰、重复性好的扩增图谱(图。再根据扩增条带类型,确定了44图引物I 29/I 38和I 21/I 22对部分菌株PCR 扩增结果Fig.R esults of PCR amplification using primers I 29/I 38and I 21/I 22from Beauveria bassiana isolates株供试菌株的内含子类型(表2。212球孢白僵菌野生种群的内含子单倍型分析通过对4个插入位点的内含子分析,球孢白僵菌的44株野生菌株表现为8种核型(表2。其中以BABA 型最多,共计35株,占

16、79155%;其次是BC BC 和BC BA 型,计2株,占4154%;而BAAA 等5个单倍型各仅有1株,分别占2127%。在明光地区马尾松毛虫种群引起流行病的球孢白僵菌种群是一个异质的种群,而BABA 型菌株是引起流行病的优势菌株。说明这类菌株在该地区有着较强的野外适应能力。213各插入位点的内含子频率分析球孢白僵菌28S rDNA 的D92D11区域存在4个内含子插入位点,但对于不同的插入位点,其内含子出现频率却极不相同(表3。同位点的内含子插入频率在4155%至97173%之间变动,存在巨大差异。位点Ec2563和位点Ec2066有插入内含子(为A +C 之和的菌株分别占93118%和

17、97173%;与之相反,位点Ec1921和Ec2449有插入内含子的菌株仅各占0和4155%。041中国生物防治第26卷表2不同内含子单倍型在球孢白僵菌种群中的分布频率与所含菌株T able2Distribution frequencies and isolates of the different intron2h aplotypes in populations of Beauveria bassiana内含子单倍型Intron halotypes (Bb1,Bb2,Bb3,Bb4菌株数Numberof is olates所占比例(%Percentage所含菌株Is olatesBABB1

18、2127MG44BABA3579155MG04,MG05,MG07,MG08,MG10,MG12,MG15,MG16,MG17,MG18,MG19,MG20,MG21,MG22,MG25,MG27,MG28,MG29,MG30,MG37,MG38,MG41,MG48,MG52,MH55,MG56,MG57,MG59,MG60,MG61,MG63,MG66,MG68,MG70,MG71 BAAA12127MG06BC BC24154MG49,MG67BC BA24154MG18,MG50BCAC12127MG73BABC12127MG31BBBA12127MG01表3四种内含子在28S rDNA

19、四个位点的分布频率和比率T able3Distribution frequencies and ratio of b and type at4sites in28S rDNA产物类型T ype of product位点Ec2563S ite位点Ec2449S ite位点Ec2066S ite位点Ec1921S ite频率Frequency比率(%Ratio频率Frequency比率(%Ratio频率Frequency比率(%Ratio频率Frequency比率(%RatioA398816324155388613600B3618242951451212744100C241550051113600

20、3讨论28S rDNA型内含子分析提供了一种较为稳定、可靠的昆虫病原真菌种下分型的分子生物学方法,在本研究中揭示了在一场流行病中涉及到的球孢白僵菌菌株较高的种群异质性。然而,这一标记所携带的遗传多样性信息量毕竟较小,其表达的信息量不足以精确地代表某个特定菌株。如采用SSR2PCR、ISSR2PCR、AF LP2PCR等更为精确的分子标记,还可对这种异质性进行更深入的认识。昆虫的流行病和地方病是同一种病原物引起疾病的两个不同时期。流行病不常发生,但发病率很高,能迅速摧毁昆虫种群;地方病较为常见,但发病率很低,病原物与寄主保持平衡状态。对昆虫的真菌流行病来说,高密度而聚集的易感寄主昆虫和适宜的环境

21、条件是必不可少的,然而更重要的是侵染力和流行潜力较强的菌株。本研究的球孢白僵菌种群具有较高的种群异质性,其中BABA单倍型菌株为优势株,占整个种群数量的79155%。我们也发现,在黄山市牯牛降的大褐蜩蝉(Graptopsaltria nigro f uscata中引起显著流行病的蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae的48个分离株,也表现出高度的异质性和优势性(另文发表。一般认为,异质性强的种群可以在一定程度上维持其种群的稳定态,并且还能增强该种群对某一生态环境的适应能力,而异质性弱的种群极易受遗传漂变而造成基因的随机丧失和固定19。因此,在筛选防治农林害虫的球孢白僵菌菌株时,似应

22、选择BABA或BBBA这类优势菌株。然而,彭凡等20从半干旱的内蒙准格尔旗的沙棘木蠹蛾(Holcocerus hippophaecolus中流行的球孢白僵菌种群中分离141第2期刘玉军等:马尾松毛虫种群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的异质性中国生物防治第26卷出的7个菌株,仅表现出极低的遗传分化。我们在研究柱孢绿僵菌(Metarhizium cylindrosporum于皖东琅琊山和皇甫山两个自然保护区的流行时也发现,两个种群间遗传距离虽然很大,但种群内的异质性却很低,各有明显的优势株(另文发表。因此,流行株种群异质性与流行病的关系比较复杂,尚需进一步的研究。尤其需要结合这些流行株的表型性状来研

23、究,例如对寄主昆虫的毒力以及环境适应性等。本研究44株白僵菌从形态鉴定的角度未发现有明显的形态区别,对今后其他菌株的相关研究有一定的启示。参考文献1蒲蛰龙,李增智.昆虫真菌学M.合肥:安徽科技出版社,199612李增智,韩宝瑜,樊美珍,等.应用球孢白僵菌防治马尾松毛虫的策略及其生物多样性基础的研究J.应用生态学报,1998,9(5:503-51013王滨,樊美珍,李增智.马尾松林生态系统中球孢白僵菌种群动态研究J.应用生态学报,2002,13(11:1368-137214丁德贵,李增智,樊美珍,等.球孢白僵菌种群在松林中的寄主转移及遗传多样性对松毛虫持续控制的影响J.应用生态学报,2004,1

24、5(12:2315-232015赵学球,蔡守平,王四宝,等.球孢白僵菌释放后在森林系统中定殖及持续控虫作用的证据J.菌物学报,2007,26(1:84-8816S t Leger R A,Allee L L,M ay R,et al.W orld2wide distribution of genetic variation am ong is olates of Beauveria spp.J.M ycologi2cal Research,1992,96:1007-101517de Muro M A,M ehta S,M oore D.The use of am plified fragmen

25、t length polym orphism for m olecular analysis of Beauveria bassianais olates from K enya and other countries,and their correlation with host and geographical originJ.FE MS M icrobiology Letters,2003, 229(2:249-25718G aitan A,Valderrama A M,Saldarriaga G,et al.G enetic variability of Beauveria bassi

26、ana ass ociated with the coffee berry borer Hy2pothenemus hampei and other insectJ.M ycological Research,2002,106:1307-131419G lare T R,Inw ood A J.M orphological and genetic characteristics of Beauveria spp.from New Z ealandJ.M ycological Research,1997,102:250-256110M aurer P,C outeaudier Y,G irard P A,et al.G enetic diversity of Beauveria bassiana and relatedness to host insect rangeJ.M yco2logical Research,1997,101:159-164111陈名君,张中,樊美珍,等.利用28