PM表型芯片技术在微生物相关研究领域中应用1

1、Phenotype Microassays（PMs，表型芯片技术）在微生物相关研究领域中的应用表型芯片表型芯片概述及基本原理表型（Phenotype），又称表现型，对于微生物而言，表型就是它表现出来的所有性状，如外观、生理生化特性、抗药性等等。表型是基因型的表现形式，它揭示了基因的功能，因此表型是从基础遗传学到生物学理解途径上的重要媒介物。 DNARNAPROTEINPHENOTYPEOFarrell, 1975Molecular Analyses Affymetrix, 1993Cellular AnalysisBiolog, 2000which is more conclusive kin

2、etic全球细胞分析三大工具 基因芯片、蛋白组、表型PM技术可以允许以同一标准模式同时高通量测试上千种细胞表型，非常高效、快速。通过对活体细胞测试，可以检测细胞基因变化后或用药后所引起的细胞表型的变化情况。Traditional Phenotype Testing 传统表型分析Cells: bacteria fungiGrowth Medium Tests: C-source N-source P-source S-source pH osmolarity drugs etc.Traditional Phenotype Testing 传统表型分析Hundreds/Thousands of S

3、eparate Growth Conditions成百上千孤立的生长条件Cells: bacteria fungiHundreds/Thousands of Separate Metabolic Curves成百上千孤立的代谢曲线Kinetic Monitoring相对孤立，实验繁琐，周期长，平行性难以保证，耗费大量人力、物力。Metabolic Curve Comparisons代谢曲线比较TimeControlMetabolismTimeExperimentMetabolismTimeComparisonMetabolismPhenotype MicroArrays SystemParen

4、t Cell Line Vs. Test Cell Line (Gene KO/Drug)母细胞系vs测试细胞系（基因改变/用药）OmniLog PM SystemAutomated AnalysisExperimentReferenceBioinformatic software生物信息软件PM PatternOmniLog PM SystemPM Kinetic Result 1 hr setup automatic24-48 hr2000 种表型测试1-2天完成测试Name Strain Number OtherTestEP005MG1655 malF3089:Tn10RefMG1655

5、FB1998 versionE.coliPhenotypes Gained - Faster Growth / ResistancePMWells Test Difference Mode of ActionPM16B 3Norfloxacin75DNA topoisomerase, quinolonePM20F 6, F 7, F 8Oxytetracycline239protein synthesis, tetracyclinePM12B 7, B 8Penimepicycline207protein synthesis, tetracyclinePM13D 11, D 12Rolitet

6、racycline183protein synthesis, tetracyclinePM12A 7, A 8Tetracycline182protein synthesis, tetracyclinePM13C 6, C 7Doxycycline177protein synthesis, tetracyclinePM11D 8Demeclocyline104protein synthesis, tetracyclinePM11A 7, A 8Chlortetracycline94protein synthesis, tetracyclinePM11H 3, H 4Cephalothin127

7、wall, cephalosporinPhenotypes Lost - Slower Growth / SensitivityPMWells Test Difference Mode of ActionPM02A 6Dextrin-100C-sourcePM01E 10Maltotriose-89C-sourcePM01C 10Maltose-78C-sourcePM04A 5Tripolyphosphate-63P-sourcePM16E 2Streptomycin-133protein synthesis, aminoglycosidePHENOTYPE MICROPLATES表型分析微

8、孔板表型芯片测试组CarbonNitrogen (peptides)PhosphorousSulfurBiosynth.PathwayspH Chemical SensitivityMetabolicSensitivityNitrogen (amino acids)Osmotic & Ionic细胞呼吸涉及的常见表型反应(已报道的)Dyered(Colored)有色的染料GrowthNADH电子在细胞膜或线粒体上转移无色的染料PS转运代谢环境影响因素NGrowthNADHCarbon80020010002000表型数量抗生素或毒物Add cells每个孔含不同的测试，不同的代谢路径使用

9、染料进行的细胞呼吸代谢测试染料法与浊度法相比，具有良好的相关性Omnilog的信号与 490nm测吸光度值相比，同样相关性良好APPLICATION EXAMPLES 应用举例PMs技术在微生物领域中的主要应用1.测试具有基因差异的细胞测试具有基因差异的细胞2.细胞系直接测试细胞系直接测试3.测试经药物或其它化学物质处理后测试经药物或其它化学物质处理后细胞表型发生的变化细胞表型发生的变化确定基因组的功能发现编码特点靶物的基因细胞系改进细胞表型稳定性测试最优化细胞培养条件最优化孢子形成和萌发的条件最优化二级代谢产物如抗生素的产生发现有用的酶活性其他细胞水平上的分析新药研发： 发现致病菌独有基因从

10、而确定新药物的靶位点；确定药物作用机制；评估潜在药物；评估新药副作用；新药与其他已知药物的增益作用或有害相互作用。毒理测试：PMs代替动物实验更经济、更人道、更准确快速4.其它农业或工业微生物研究其它农业或工业微生物研究基因型 表型 用表型芯片技术快速高通量测定敲除一段基因 哪种表型发生改变?插入一段基因 哪种表型发生改变?直接用PMs测试基因改变后细胞表型发生的变化ASSAYING GENES OFKNOWN FUNCTION分析已知功能的基因 Green = Phenotypes GainedTetracyclines四环素tetracyclinesDextrin胡精麦芽糖MaltoseM

11、altotriose麦芽三糖Red = Phenotypes LostE. coli malF:Tn10 vs MG1655malF基因编码与麦芽苷摄取有关的蛋白Tn10（抗四环素）转座子PM分析检测发现两种表型的改变：丧失麦芽糖、麦芽三糖和糊精代谢以及具有抗四环素属性。ASSAYING GENES OFUNKNOWN FUNCTION分析未知功能的基因b1006-b1012Low, Kustu, and coworkers PNAS (2006) 103:5114E. coli b1012 操纵子被敲除后-Low, Kustu, and coworkers PNAS (2006) 103:5

12、114图中只显示了PM3板的结果，突变菌株不能利用胞嘧啶、尿嘧啶和尿苷。b1012是E.Coli K-12的操纵子，对嘧啶降解途径起调控作用。 cytosine(胞嘧啶) uracil, uridine(尿嘧啶和尿苷)-PM分析E.coli b1012操纵子被敲除后氮代谢发生的变化AUXOTROPH IDENTIFICATION营养缺陷型的鉴定Global View of Metabolic Response(Wild Type Strain)代谢反应的整体观察（野生型菌株）PM 5PM 6PM 7PM 8PM 4PM 3Wild Type Strain: PM 5 野生菌株: PM 5Con

13、trolL-Leucine结论：PM 6-PM 8 的结论验证了PM 5的发现，亮氨酸对生长是必需的，支持生长的肽中都含有亮氨酸。PeptidesPeptidesAsp-LeuSer-LeuLeu-AlaThr-LeuLeu-ArgTrp-LeuLeu-AspTyr-LeuLeu-GluIle-LeuLeu-GlyLeu-AsnLeu-MetLeu-TyrLeu-TrpD-Ala-LeuLys-LeuLeu-b-AlaMet-LeuLeu-D-LeuPro-LeuGly-Gly-D-LeuGly-Gly-LeuOTHER APPLICATIONS 其他应用Yellow AntibioticBr

14、own AntibioticThis technology should also work for optimizing toxin productionActinomycetes: Antibiotic Production放线菌 ：抗生素生产 1 2 3 4 1920 phenotypes1 - + - - - + - + + + + - - + - - +2 - - - + - + + + - - + - + - + - + 3 + - - + - + - - - + - + - + - - - -4 + + - - + - + + + - - + + + - + -1000 spec

15、ies这些数据包含很多内容:Insight into why specific microbes persist in certain ecological niches洞察特定微生物为何在生态小环境中能持续生存Insight into how to inhibit growth or kill specific microbes洞察如何抑制或杀灭特定的微生物Using PM Technology to Build a Massive Bacterial Database建立庞大的表型数据库SELECTION OF THE BEST TESTS选择最适合的测试nalidixic acid萘啶酮

16、酸抗阴性菌的药物Vancomycin万古霉素抗阳性菌Selection of the Best Tests: Gram positive vs Gram negativeNaCldiamino-pteridine二氨基喋啶Selection of the Best Tests: Aeromonas vs Vibrio1920 tests 384 tests 96 tests 优化后可以大量减少测试量生物肥料领域的应用生物肥料领域的应用微生物肥料等级评价微生物肥料等级评价传统对微生物肥料的评价通常以测定活菌数多少来评定等级。现在国际上不少大的生物肥料公司使用PMs对生物肥料进行表型测定，建立一个基于表型特性的评价模型，直接评价微生物肥料利用各种C, N, P,S源的能力，决定生物肥料的等级。微生物肥料配方及生产条件优化微生物肥料配方及生产条件优化混合菌的种类及比例优化，获得最佳利用率生物肥料载体优化，使施加到土壤中的肥料能正常生长，减少土壤原有物质或微生物的干扰生物肥料生产条件优化更多的表型需要开发更多的表型需要开发对于微生物细胞来说，PM 技术还需要继续设计一些涉及细胞内结