昆虫细胞省略的无血清培养及其特性研究

1、青岛农业大学学报(自然科学版) 26(2):131 135, 2009JornalofQingdaoAgricltralUniversity(NatralScience)文章编号:1674 148X(2009)02 0131 05昆虫细胞 BTI-Tn-5B1 -4和 Sf-9的无血清培养及其特性研究, 马明,勋(青岛农业大学无脊椎动物细胞培养和细胞工程中心, 山东 青岛 266 09)摘要:本研究对目前应用最多的两种昆虫细胞 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9在无血清培养基 Sf 900 中进行驯化和培养, 现已传至 45代以上。 比较了两种细胞在 Sf 900 和有血清培养基 TNM F

2、H中的细胞形态、生长速率、产量和重组蛋白表达水平。 结果表明, 在 Sf 900 中 Sf 9细胞比 TNM FH培养的略大, BTI Tn 5B14的圆形细胞增多, BTI Tn 5B1 4和 Sf 9在 Sf 900 中生长速度快, 群体倍增时间分别为 18.5h和 21.7h,而在 TNM FH中, BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群体倍增时间分别为 21.9h和 25.4h;在两种培养基中 BTI Tn5B1 4和 Sf 9细胞的率、多角体产量和 半乳糖苷酶(galactosidase)的表达水平均无明显差异, 而碱性磷酸酶(secretedalkalinephosphatase,

3、 SEAP)在 Sf 900 中的表达水平明显高于 TNM FH中的水平 。:昆虫细胞;无血清培养;生长曲线;号:Q813.1 1产量;蛋白表达文献标识码:AStudyonCharacteristicsofBTI-Tn-5B1 -4 andSf-9 CelsAdaptedinSerum -MediumLIYinhua, ZHENGGuiling, LIChangyou, MALIGuoxun(ACenterforAdvancedInvertebrateCelCultureandCelEnginering, QAU, Qingdao266 09,Abstract:BTI Tn 5B14 andS

4、f 9 cellines, thataredominantce lineswithbasicstudyandaplicationintheworld, wptedtoaserummedium, Sf 900 foraproximately45 pasages.Thecharacteristicsproductionandrecombinantproteinexpresionwerecomparedwith FH.TheresultsshowedthatthetwocelslineinSf 900 werelitleincludingmorphology, growthkinetics,that

5、oftheygrewinSf 900 andTNMbigerthaninTNM FH.ThecelpopulationdoublingtimesofbothBTI Tn5B14 andSf 9 celsinSf 900(18.5 and21.7 h, respectively)shortenedincomprisiontothatinTNM FH(21.9 hforBTI Tn5B14 and25.4 hforSf 9).Theinfectionrate, productionofpolyhedraandexpresionofgalactosidase(gal)inbothtypesofmed

6、iawerenotsignificantlydiferent, butheexpresionofsecretedalkalinephosphatase(SEAP)inSf 900 mediumwashigherthaninserum containingcultures.Keywords:ce lines;serumculture;growthkinetics;production;proteinexpresion自 1962年 Grace虫细胞系以来, 已经从当有吸引力的新途径, 因此, 昆虫细胞培养已在生物学、农业以及医学等领域得到广泛应用 。目前建立了世界上第一个昆100多种昆虫建立了

7、5001多株细胞系, 昆虫细胞可以作为载体生产生物,是在含有昂贵胎牛血清 (fetalbovum, FBS)的昆虫细胞表达系统的建立, 为培养基中培养昆虫细胞, 高成本限制了大规模培养另外由于杆状技术的发展, 而且血清的生产许多具有重要生物学价值的重组蛋白提供了相还会给基因工程表达收稿日期:200828基金项目: 作者简介:通讯作者:自然科学基金(3077 45 )973计划(2009CB8902)( 983 ), 女, 山东泰安人, 在读, 研究方向:昆虫细胞培养。勋,gxli青岛农业大学学报(自然科学版)26卷132产物的后处理带来。此外, 血清还是支原体和细胞形态观察和大小的测量 :在不

8、同培养基中培养的细胞, 28条件下培养 , 在 OlympusIX71 倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍照, 随机选取100个细胞, 通过显微标尺测量细胞的大小。细胞生长曲线的测定:取对数生长期细胞 , 用血球计数板计数后, 用相应培养基稀释到 25210 cels/ml的浓度 , 加到 25cm 培养瓶中, 每瓶5ml, 28条件下培养。每天取 3 瓶细胞, 用血球计数板计数, 计算细胞的平均浓度, 绘出细胞生长曲污染的重要来源。无血清培养基的优其它点在于化学成分明确, 培养条件容易, 减少了不同批次培养基之间在数量和质量上的差异, 除去了微生物污染的潜在来源, 利于细胞培养产物的分离等操作

9、。因此发展昆虫细胞无血清培养基一直是细胞培养工程领域的研究热点 。目前世界上应用最多的 细 胞 系 主要 是 来 源 于 草 地 贪 夜蛾(Spodopterafrugiperda)的 Sf 21或其克隆株 Sf2, 39和粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)的 BTI Tn5B1线, 并按 Hayflick等时间。侵染和 产量的测定 :取对数生长期的细胞, 血球计数板计数后, 按 1.0 105 cels/孔的量接入 24孔细胞培养板中, 3次重复;28培养 2h, 吸的计算细胞群体倍增4(HIGHFIVE), 本文对 Sf 9和 BTI Tn5B14进行无血清培养和驯化, 并研究在无

10、血清培养条件下细胞的生物学特性, 为重组蛋白和量生产提供理论依据和有效途径。1 材料和1.1 材料杀虫剂的大去培养基, 每孔加入 AcMNPV 1A复数MOI=10), 吸附 1h后弃去液, 每孔加入 1ml新鲜培养基, 28培养并观察, 120h后检查侵染细胞系 :BTI Tn5B14(HIGHFIVE)细胞系 ,结果,多角体 (OB)产量的测定参照 Wang。5 的康奈尔大学 Granados博士惠赠 ;Sf 9细胞康奈尔大学 Blisard博士惠赠。由系, 由等碱性磷酸酶 (SEAP)和 半乳糖苷酶 ( gal)的表达:取对数生长期细胞, 按 1.0105 cels/孔的量接入 24孔板

11、中, 28培养 2h, 吸去培养基,:苜蓿银纹夜蛾核型多角体昆虫(AutographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisAcMNPV)AcMNPV 1A株以及重组Ac康AcMNPV SEAP和 AcMNPV gal将重组MNPV SEAP和 AcMNPV 奈尔大学 Granados博士惠赠 。gal等, 均由按复数 MOI=10 的比例细胞, 吸附 1h后弃去液, 每孔加入 1ml新鲜培养基 , 28条件下67的培养基 :有血清培养基为 TNM FH昆虫细胞培养基, 由 Grace细胞培养基 (GIBCO)改进并辅以 10%胎牛血清 (MD genic

12、s公司 ), 无血清培养基为 Sf 900 SFM昆虫细胞培养基(GIBCO)。1.2细胞的传代培养 :待细胞生长铺满 25cm2 培养瓶 (Corning公司 )瓶底 , 在超净工作台中用吸管轻轻吹打贴壁细胞, 制成细胞悬液, 取 1ml细胞并加入 4ml新鲜培养基于培养瓶中, 置于 28 培养箱中静置培养, 每隔 3 4d传代 1次。细胞的无血清培养和驯化 :将在含 10%胎牛血培养, 按 Davis等 和 Zheng等蛋白的表达。2 结果与分析2.1 细胞的无血清培养和驯化, 测定重组两种细胞从含 10%FBS的 TNM FH培养基分别经过含 8%、5%、3%和 1%FBS的 Sf 90

13、0 SFM培养基, 最后到 Sf 900 SFM无血清培养基的适应过程中, BTI Tn5B1 4的驯化过程较慢, 细胞在含 8%和 5%FBS的培养基中 , 培养的第 1胞表现出生长缓慢, 部分细胞悬浮破碎, 需及时更换新鲜培养基, 当细胞生长铺满培养瓶底时进行传代,传代 3次后, 细胞生长状态良好。在转到含 3%FBS的培养基时, 细胞比在 TNM FH培养基中的略大, 生长缓慢且率高, 驯化过程较长, 培养 10细胞生长逐渐。继续驯化到含 1%FBS的培养基, 直至 Sf 900 SFM中 , 最初培养的 1 2胞生长均较缓慢, 当适应后生长速率则明显加快, 平清的 TNM FH培养基中

14、生长的 BTI Tn5B14和 Sf 9细胞, 按细胞的传代培养, 分别依次传代于含 8%、 5%、 3%、 1% FBS的 Sf 900SFM培养基中 , 在每种 FBS浓度的培养基中适应并传 3, 再于下一个 FBS浓度的培养基中能培养, 直至在完全无血清培养基 Sf 900 SFM中适应并传代。2期, 等:昆虫细胞 BTI Tn 5B14和 Sf 9的无血清培养及其特性研究133均每 3d正常传 1代, 整个驯化过程用了 42.85m Tn5B118.592.40m;而在TNM FH中 BTI的时间。与 BTI Tn5B14相比, Sf 9的适应较快, 大约经历 45d的时间就能够在 S

15、f 900 SFM中生长并正常传代培养。目前 BTI Tn5B14 和 Sf 9已在无血清培养基中分别传代 45代和 48代。2.2 细胞的形态比较BTI Tn5B14 和 Sf 9 两种细胞在 TNMFH和 Sf 900 SFM培养基中的形态见图 1。在 Sf 900 SFM中, BTI Tn5B14 细胞变得短而粗,而且圆形细胞增多, 大约占 37.3%, 直径为 19.644 圆形细胞的比例约为 10.0%, 直径为16.563.01m, 梭形细胞占大多数, 约占 90.0%,大小为 52.164.52m 15.542.30m。 Sf 9细胞在两种培养基中均为圆形, 在 Sf 900 S

16、FM中略微变大, 细胞直径为 16.19TNM FH中为 14.742.03m。1.37m, 而在2.3 细胞的生长曲线与群体倍增时间BTI Tn5B14和 Sf 9在 Sf 900 SFM中连续传代 20代以后 , 细胞生长迅速 , 状态良好 。2.65m, 梭形细胞约占62.7%, 大小为36.42细胞生长曲线见图 2。在 Sf 900SFM中, BTI图 1 BTI Tn5B1 4和 Sf 9细胞在两种培养基中的形态A.TNM FH中的 BTI Tn5B 4 细胞;B.Sf 900 SFM中的 BTI Tn5B4细胞;C.TNM FH中的 Sf 9细胞;D.Sf 900 SFM中的 Sf

17、 9细胞图 2 两种细胞在不同培养基中的生长曲线A.BTI Tn5B 4 细胞;B.Sf 9 细胞青岛农业大学学报(自然科学版)26卷1346Tn5B14细胞最高密度可达 2.3410 cels/ml, Sf 9细胞最高密度可达 2.7510 cels/ml。在 Sf900 SFM中 , BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群体倍增时间分别为 18.5h和 21.7h, 均比在 TNM FH中生长速度快, 在 TNM FH中 , BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群体倍增时间分别为 21.9h和 25.4h。3。 BTI Tn5B14和 Sf 9细胞在两种培养基中6对 AcMNPV均比较敏感

18、,率均在 90%以上。BTI Tn5B1 4 细胞在 Sf 900 SFM和 TNMFH中的多角体产量分别为 81.73 和 80.15 OBs/ cel, 二者差异不显著, 但均显著高于 Sf 9 细胞的多角体产量。 Sf 9细胞在 Sf 900 SFM和 TNM2.4FH中的多角体产量分别为cel, 差异也不显著。31.95和29.96 OBs/的侵染和产量侵染和多角体产量测定结果见附表和图图 3 AcMNPV对两种培养基中 BTI Tn5B1 4和 Sf 9细胞的侵染A.TNM FH中的 BTI Tn5B 4 细胞;B.Sf 900 SFM中的 BTI Tn5B4细胞;C.TNM FH中

19、的 Sf 9细胞;D.Sf 900 SFM中的 Sf 9细胞两种培养基中 BTI Tn5B14和 Sf 9细胞的侵染率和产量比较4在 Sf 900 SFM和 TNMFH两种培养基中附表的 半乳糖苷酶( gal)表达量在第 8 d达到最高, 分别为 1.86 10 IU/ml和 1.54 10 IU/ml, 差异不显著 ;Sf 9细胞在两种培养基中的表达量在第 8 d也达到最高, 分别为 0.88 10 IU/ml和 0.6210 IU/ml, 差异也不显著。而 BTI Tn5B14 在 Sf900 SFM中碱性磷酸酶 (SEAP)的表达水平较TNM FH中有显著提高 , 第 7d的表达量分别为

20、3.90 IU/ml和 2.28 IU/ml;Sf 9在 Sf 900 SFM中 SEAP的表达量也较 TNM FH中高, 第 7 d的表达量分别为 0.69 IU/ml和 0.41 IU/ml。从图 4 还可看出, BTI Tn5B14细胞表达两种重组蛋白的水平均较 Sf 9高, 大约是 Sf 9表达量的 2 5倍。侵染率(%)多角体产量(OBscel)细胞培养基BTI Tn5B4TNM FH Sf 900 SFMTNM FH97.594.294.692.380. 5 8 .73 29.963 .952.35 A.52 A.38 B2.24 BSf 9Sf 900 SFM注:相同字母表示差异

21、不显著(P<0.0 )。2.5半乳糖苷酶 (gal)和碱性磷酸酶(SEAP)的表达重组蛋白的表达结果 (图4)可见, BTI Tn5B12期, 等:昆虫细胞 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9的无血清培养及其特性研究135图 4BTI Tn5B14和 Sf 9细胞在两种培养基中重组蛋白的表达水平A. 半乳糖苷酶( gal)的表达;B.碱性磷酸酶(SEAP)的表达良好基础。3讨论参考文献:昆虫细胞的无血清培养在大量生产杀虫剂 GranadosRR, LiGX, BlisardGW.Insectcelcultureandbio-technology J .VirologicaSinica,

22、 2007, 22(2):83 93.和表达重组蛋白方面具有十分广阔的应用前景, 有研究者对昆虫细胞的无血清培养进行了一些尝试和 2,萌.昆虫细胞无血清培养 J .细胞生物5, 8 10, 为大规模的商业化生产奠定了理论基研究学杂志, 2005, 27(2): 27 32.TaticekRA, ChoiC, PhanSE, etal.Comparisonofgrowthand recombinantproteinexpresionintwodiferentinsectce linesinat- tachedandsuspensionculture J .BiotechnolProg, 200

23、, 7(4):676 684.HayflickL.Theoryofpopulationincreasebysubcultivation.Tisue culturemethodsandaplication.(eds, KrusePF, PatersonM K) M .AcademicPres, NY. 973, 222 223.础。本文通过对目前国际上应用最多的 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9 细胞系进行无血清培养驯化和生物学特性比较, 发现 Sf 900 SFM无血清培养基可以提供以上两种细胞快速生长所需的营养, 并实现高产量的 增殖和高水平的蛋白表达, 为昆虫细胞在无血清条件下的大规模

24、培养提供有效的途径。 3 4 5WangP, GranadosRR, ShulerM L.Studiesonserumcul-tureofinsectcelsforpropagationandrecombinantproteinpro-无血清培养是今后昆虫细胞的必然趋duction J .Invertebr.Pathol., 992, 59:46 53. DavisTR, TroterKM, GranadosRR, etal.Bacul势, 目前商业化生产的无血清培养基通常有很高的细胞特异性, Sf 900 SFM是一种适用于 Sf 9和Sf 21等细胞系的无血清培养基, 因此, Sf 9 细胞 6expres-sionofalkalinephosphataseasareportergeneforevaluationofpro-duction, glycosylationandsecretion J .BioTechnology,992,0: 4850.在其中的适应较快, 而 BTI Tn 5B14细胞的适 7ZhengGL, LiCY, LiGX, etal.Constructionandcharacteris-t