水产品中环丙沙星检测技术的研究进展

1、收稿日期 :2009-05-07作者简介 :孙建华 (1981-, 女 , 硕士 , 主要从事水产品药物残留检测。水产品中环丙沙星检测技术的研究进展孙建华 王庆贺 郭霞 黄德凤 (上海水产研究所质量监督检验站 , 上海 200433摘 要 :综述了水产品中环丙沙星残留的各种检测技 术 , 包 括微生 物法、 液相色 谱法、 高效液 相色谱 法、 高 效薄层色谱法 、 液相色谱 -质谱联用法、 免疫分析法、 高效毛细管电泳法等 , 介绍了各种方法的优缺点。 关键词 :水产品 ; 环丙沙 星 ; 药物残留 ; 检测技术1简介环丙沙星 (C ipr o floxacin 的分子式为 C 17H 18

2、F N 3O 3, 分子量 331. 34, 是氟喹诺 酮类药物中抗菌 活性最强的品种 , 其结构式见图 1。图 1 环丙沙星的结构式由于其强抗菌能力和广谱抗菌特点 , 水产上 过去常用以治疗烂鳃病、 赤皮病等细菌性感染病。但人体长时间低剂量摄入环丙沙星会导致对所有 喹诺酮类抗生素产生耐药性。而且研究表明 , 环 丙沙星具有较严重的肝肾毒性 , 所以欧盟和北美 等 国家已 禁止在 水产养 殖业 中使用 环丙沙 星 , 2002年我国农业部也将该药列 为水产养殖禁用 药物。但因其疗效显著 , 目前还是有很多渔民违 规使用。我国是水产品出口和消费大国 , 为保护 水产品国际贸易的顺利进行和保障消费

3、者的食用 安全 , 对水产品中残留的环丙沙星进行科学准确的检测显得非常重要。2对水产品中环丙沙星的检测方法目前 , 对水产品中环丙沙星的检测方法包括 微生物法、 液相色谱法、 高效液相色谱法、 液相色 谱 -串联质谱法、 免疫分析法等。其中国家公布 的与水产品中环丙沙星检测相关的标准和公告包括 :农业部公告第 236号 动物源食品中 恩诺沙 星和 环丙 沙 星残 留 检测 方 法 -高效 液 相色 谱 法 ; 农业部 783号公告 -2-2006 水产品中诺 氟沙星、 盐酸环丙沙星、 恩诺沙 星残留量的测定 液相色谱法 ; GB /T20751-2006 鳗鱼及制品中十五钟喹诺酮类药物残留量的

4、测定 液相色谱 -串联质谱法 ; GB /T20366-2006 动物源产品中 喹诺酮类残留量的测定 液相色谱 -串联质谱 ; GB /T21312-2007 动物源性食品中 14种喹诺 酮药物残留检测方法 液相色谱 -质谱 /质 谱法 ; 农业部 1077号公告 -1-2008 水产品中恩诺沙 星、 诺氟沙星和环丙沙星残留的快速筛选测定 胶 体金免疫渗滤法 。本文将结合这些标准对水产 品中环丙沙星的检测方法进行综述。 2. 1微生物法微生物法是抗菌药物残留检测的一种快速筛 选方法。较常用 的是 Oker m an 等 (1998 改进的189水产科技情报 2009, 36(4欧洲四平皿法 (

5、four-p late tes, t FPT, 四平皿法虽 能检测高浓度药物的残留 , 但其检测限高于欧盟 所规定的 MRL, 所以在目前的实际检测工作中已 很少采用。2. 2液相色谱法反向液相色谱法 (liqu i d chro m atography , LC 操作简单 , 方法灵活 , 是前些年用来检测氟喹诺酮 类药物残留常用的方法。 Jefferry 等 (1994 报道 了用 LC 法测定沙拉沙星在海峡鲇鱼中的残留。 但由于此类药物结构中的叔胺基和羧基团能在水 中发生解离 , 固定相表面的这些活性位点可通过 氢键或离子交换作用对药物产生强烈吸附 , 出现 色谱峰拖尾 , 保留值不稳定

6、或过长 , 甚至被长期保 留在色谱柱上 , 导致峰形异常和分离度下降 , 这些 都影响了检测的准确性。2. 3高效液相色谱法高效 液 相色 谱法 (high -perfor m ance li q u i d chro m atography , HPLC 是目前检验水产品中环丙 沙星最常用的方法。农业部公告第 236号和农业 部 783号公告 -2-2006两个标准中均采用高效 液相色谱法进行检测。农业部公告第 236号中规定的检测方法 :样 品经盐酸盐缓冲液提取 , 离心 , 上清液过固相萃取 柱净化后用流动相洗脱 , 用带荧光检测器的高效 液相色谱仪测定 , 以外标法定量。色谱柱 :反相

7、色 谱柱 C18柱 (150mm ! 4. 6mm 或相当性能 ; 流 动相 :0. 05m o l/L磷酸溶液 , 三乙胺 -乙腈 (82+ 18; 流速 :1. 0mL /mi n ; 荧光检测波长 :激发波长 280nm; 发射波长 450n m 。该方法的检出限为 20 g /kg。笔者经多次实验 , 该方法回收率为 80% 95%。农业部 783号公告 -2-2006规定的检测方 法 :样品经无水硫酸钠脱水 , 酸化乙腈提取 , 离心 , 取上清液加正己烷除脂肪。蒸干萃取液 , 流动相 溶解残渣 , 离心取上清液 , 并经微孔滤膜过滤 , 用 带荧光检测器的高效液相色谱仪测定 , 以

8、外标法 定量。色谱柱 :反相色谱柱 C18柱 (150mm ! 4. 6 mm 或相当性能 ; 流动相 :乙腈 :四丁基溴化铵溶 液 =5 95(V V , 流速 1. 5mL /mi n , 荧光检测器 检测 , 激发波 长为 280nm , 发射波长 为 450n m 。 该方法的检出限为 1. 0 g /kg。笔者经过多次实 验此外 , 关于环丙沙星残留检测 HPLC 法的改 进研究也有许多报道。总的来说 , H PLC 法灵敏 度高 , 检出限低 , 方法稳定 , 特异性强 , 较其他检测 方法具有明显的优势 , 适合于作确证性检测 , 所以 目前应用非常广泛。该方法的缺点是样品的前处

9、 理较繁琐 , 仪器费用相对较高。2. 4高效薄层色谱法高效薄层色谱法 (h i g h perfor m ance th i n layer chro m atography , H PTLC 的 出 现 使 薄 层 色 谱 法 (thin layer chro m atography , TLC 进 入了 新 的 时 期 , 现已成为仅次于 HPLC 的药物残留分析方法。 H PTLC 的斑点原位扫描定量、 定性和高效分离材 料 (5310 m 改变了常规 TLC 在灵敏度和重现 性方面的不足 , 但保持了 TLC 简便、 快速和样品 容量大的优点 , 可使用正相或反相板 , 分辨率几乎

10、与 H PLC 相 当。 HPTLC 在兽药残 留的快速 筛选 性检测方面应用广泛。但目前用该法进行水产品 中环丙沙星的检验在大批量样品的检测中应用较 少 , 还处于实验室方法摸索阶段。2. 5液相色谱 -质谱联用法液相色谱 -质谱 联用法 (liquid chr o m atogra phy-m ass spectrog raphy , LC -M S 的灵敏度 高 , 能方便地对微量兽药残留组分进行检测 , 同时能 对兽药残留组分进行结构确证。尤其是高效液相 色谱 -串联质谱法 (HPLC -M S /M S , 其 性能更 是在 LC -M S 的基础上有了进一步提高 , 是近几 年迅速

11、发展起来并在实 践中得到广泛应 用的方 法。该方法尤其能在多组分残留的确证检测中发 挥重要作用。在环丙沙星相关检测方法中 , GB /T 20751-2006、 GB /T20366-2006和 GB /T21312 -2007中规定的方法均采用 H PLC -M S /M S 法。 GB /T20751-2006中规定的检测方法 :试样 中残留的喹诺酮类药物采用乙腈提取 , 提取液经 正己烷液液分配脱脂后 , 以强阳离子固相萃取小 柱净化 , 液相色谱 -串联质谱法测定 , 以外标法定 量。色谱柱 :C18柱 , 5 m, 150mm ! 2. 1mm 或相 当者 ; 流速 :200 L /

12、min , 柱温 :30#。采 用电喷 雾源 ESI 、 多反应检测 (MR M 正离子模式。该方 法对鳗鱼中 15种喹诺酮类药物的检出限均为 5 g /kg。笔者经多次实 验总结 , 该 方法的回 收率 在 75%95%。/T190水产科技情报 2009, 36(4中 11种喹诺酮类药物残留的检测 , 其检测方法 :样品经甲酸 -乙腈 (98 2, V V 提取 , 提取液经正 己烷净化。液相色谱 -串联质谱仪测定 , 以外标 法定量。色谱柱 :C18柱 , 流动相 :乙腈 +2%甲 酸溶液 , 流速 :0. 8mL /mi n , 采 用电喷雾源、 多反 应检测正离子模式。该方法对样品中环

13、丙沙星的 检出限为 0. 1 g /kg, 回收率为 70%100%。 GB /T21312-2007中规定了 14种喹诺酮类 药物残留的检测方法 :样品经 0. 1m ol/LEDTA -M ellvaine 缓冲液 (p H =4. 0 提取 , 过滤、 离心 , 上 清液经 HLB 固相萃取柱净化 , 高效液相色谱 -串 联质谱检测。用阴性样品基质加标外标法定量。 色谱柱 :C18柱 (100mm ! 2. 1mm, 1. 7 m 或其 他等效者 ; 流动相 :A:40+60甲醇 -乙腈溶液 , B : 0. 2%甲酸水溶液梯度淋洗 ; 流速 :0. 2mL /mi n , 采用电喷雾源

14、、 多反应检测正离子模式。该方法 对样品中环丙沙星的检出限为 2. 5 g /kg, 对水 产品样品的回收率为 75%110%。因其具有检出限低、 精密度高 , 尤其适合多残 留药物同时定量定性检测等优势 , HPLC-MS /M S 法是近年来在环丙沙星甚至所有药物残留检测中 最受关注 的方 法 , 我 国也陆 续颁 布了 3项采 用 H PLC-M S /MS 方法进行喹诺酮类药物多残留检 测的方法。但该方法的前处理相对比较繁琐 , 对 操作人员的技术要求较高 , 仪器费用昂贵。 2. 6免疫分析法免疫分析法 (i m m unoassays , I A S 是以抗原抗 体的结合反应为基础

15、的分析技术 , 特点是特异性 高 , 简单、 灵敏、 快捷 , 其中核心试剂是抗体。免疫 学方法较微生物方法和理 化分析方法灵 敏度更 高 , 除质谱方法外 , 其特异性最好。免疫学方法主要有 ELI SA 方法 , 胶体金试纸 条和蛋白质芯片 , 流动注射免疫分析 , 荧光免疫测 定法和 免 疫 传 感 器 等 方法。这 几 种 方 法 中 以 ELISA 方法灵敏度和特异性最高 , 单个检测成本 最低。 ELI SA 试剂盒为定量方法 , 灵敏度可达纳 克级 , 操作相对简单 , 样本处理后一次可进行上千 个样本的检测 , 可实行单个药物检测或多残留检 测。试纸条方法为定性方法 , 其特点

16、为操作简单 , 样本处理后检测时间短 , 但灵敏度比 EL I SA 试剂 盒低 510倍 , 特异性差 , 仅适合残留限量要求不 进行多残留检测 , 但灵敏度需进一步提高。 胶 体 金 免 疫 测 定 法 (collo i d al go l d i m m une technique CGI A 是一项利用胶体金颗粒作为标记 物的新技术。抗原或抗体能够吸附胶体金颗粒表 面形成一个蛋 白质层 , 形成稳定的蛋 白质溶液。 以条状纤维层析材料为固相 (通称试纸条 , 通过 毛细作用使样品溶液在层析条上泳动 , 并同时使 样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体 (如抗体或抗原 发生高特异、

17、高亲和性的免疫反 应 , 层析过程中免疫复合物被富集或截流在层析 材料的一定区域 (检测带 , 通过酶反应或直接运 用可目测的标记物 (如胶体金 而得到直观的实 验现象 (如显色 。而游离标记物则越过检测带 , 达到与 结 合 标 记 物 自 动分 离 之 目 的。农 业 部 1077号公告 -1-2008中规定了对水产品中恩诺 沙星、 诺氟沙星和环丙沙星残留的快速筛选测定 的胶体金免疫渗滤法。该方法只适合于大批量样 品的粗筛 , 对于阳性样品需经色谱检测定性。 2. 7高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法 (h i g h-perfor m ance capil lar y e lectroph

18、oresis , H PCE 是 近年来发展起 来的 一项新技术 , 具有操作简单、 色 谱柱不受样品污 染、 分析速度快、 分离效率高、 样品用量少、 运行成 本低等优点 , 有利于实际样品的分析。目前这一 方法在实际检测水产品中的环丙沙星时应用得较 少。3结语自各国相继在水产 养殖中禁用环丙 沙星以 来 , 对于其检测方法的研究也越来越 受到关注。 我国于近几年加紧颁布了多个相关检测方法 , 许 多研究人员也在从事相关领域的研究。随着技术 的发展和完善 , 检测方法的准确性和精密度等也 会继续提高 , 在具体的检测工作中 , 应根据实际情 况选择合适的检验方法。参考文献1中华人民共和国农业

19、部 . 农业部公告第 236号 动物源食品中 恩诺沙星和环丙沙星 残留检测 方法 -高效液 相色谱 法 S .北京 :中国农业出版社 , 2007.2中华人民共和国农业部 . 农业部 783号公告 -2-2006水产 品中诺氟沙星、 盐酸环丙沙星、 恩诺沙星残留量的测定 液相 ( 191水产科技情报 2009, 36(43讨论据报道 , 有机磷农药对动物体内的乙酰胆碱 脂酶具有显著的抑制作用 , 会导致乙酰胆碱代谢 紊乱。一般当乙酰胆碱脂酶抑制达 40%60%时 , 动物可在几秒内死亡 1, 5, 6, 所以 , 有机磷农药 对水生生物的危害极大。根据表 2, 南美白对虾 对 毒死蜱 %极为敏

20、感 , 96h 的 LC 50值为 0. 89 g / L 。也就是说 , 即使带有极微量 毒死蜱 %的稻田 水流入养殖水体 , 也会对南美白对虾产生严重危 害。因此 , 田间使用 毒死蜱 %, 要注意对周围养 殖生物的安全距离和浓度。本次试验中观察到 , 低浓度组中 96h 后存活 下来的南美白对虾个体很少死亡 , 不摄食的情况 下能存活 56d , 说明南美白对虾受到轻度的影 响后也有一定存活率。在池塘养殖环境中 , 有机 磷农药污染后 , 易造成养殖池内部分水体药物浓 度过高 , 导致南美白对虾中毒。有研究表明 , 用微 生物对环境中的有机磷农药进行净化处理是行之 有效的 7。每年 78

21、月份是稻田使用 毒死蜱 %的高峰期 , 可采用提高生物制剂使用频率的方法 来进行预防 , 利用微生物及其产生的降解酶进行 水体中有机磷农药的去毒与净化 , 维持水体稳定。 本试验初步研究了 毒死蜱 %对南美白对虾 的单因子毒性 , 需要指出的是 , 温度、 溶解氧和 p H 等理化因子的改变也会对有机磷类农药的毒性产 生影响 , 影响 LC 50值 , 因 此在实际应用时 还应考 虑这些因子的变化。有关问题尚待进一步探讨。 参考文献1杨先乐 , 湛嘉 , 黄艳平 . 有机磷农药对水生生物毒性影响的研 究进展 J.上海水产大学学报 , 2002, 11(4:378-382. 2简慧敏 , 姚庆祯

22、 , 臧维玲 , 等 . 铜、 镉、 敌敌畏和 甲胺磷 对南美 白对虾的亚急性 毒性作用 J.生 态毒理学 报 , 2007, 2(2: 237-242.3吴邦灿 , 费龙 . 现 代环境监 测技术 M.北 京 :中国环 境科学 出版社 , 1999:252-254.4雷衍之 . 养殖水环境化学 M.北京 :中国农业出版社 , 2004: 201-203.5吴鼎勋 , 柴敏娟 , 邓小红 , 等 . 敌敌 畏对金鱼 摄食行为 的影响 J.厦门大学学报 (自然科学版 , 2001, 40(3:827-831. 6毛德寿 , 同宗灿 . 环境生化毒理学 M.沈阳 :辽宁大学出版 社 , 1986.

23、7刘云焕 , 陈东海 . 微生物降解有机磷农药的研究进 展 J.北 方环境 , 2005, 30(1:22-24.(上接第 191页 色谱法 S .北京 :中国农业出版社 , 2007.3中华人民共和国国家质量监督 检验检疫 总局 , 中国 国家标准 化管理委员会 . GB /T20751-2006鳗 鱼及制 品中十 五钟喹 诺酮类药物残留 量的 测定 液 相色谱 -串联质 谱法 S.北 京 :中国标准出版社 , 2007.4中华人民共和国国家质量监督 检验检疫 总局 , 中国 国家标准 化管理委员会 . GB /T20366-2006动 物源产 品中喹 诺酮类 残留量的测定 液相色谱 -串联

24、质谱 S .北京 :中国标准出 版社 , 2007.5中华人民共和国国家质量监督 检验检疫 总局 , 中国 国家标准 化管理委员会 . GB /T21312-2007动物源性食品中 14种喹 诺酮药物残留检测方法 液相色谱 -质谱 /质谱法 S .北京 :中国标准出版社 , 2008.6中华人民共和国农业部 . 农业部 1077号公告 -1-2008水产 品中恩诺沙星、 诺氟沙星和环丙沙星残留的快速筛选测 定 胶 体金免疫渗滤法 S.北京 :中国农业出版社 , 2008.7刘丽贞 , 周婉苹 , 薛冰 . 高效液相色谱 -荧光检测法同时测定 鱼肉组织中的诺氟沙星、 环丙沙星和恩诺沙星残留 J.中国卫生检验杂志 , 2008, 18(7:1296-1297.8谢东华 , 俞雪钧 , 殷居易 , 等 . 高效 液相色谱 -质谱联 用法检 测烤鳗中环丙沙星