链霉素诱变育种的方案ppt课件

1、11 11级生物技术班级生物技术班第二组第二组插曲(很有必要) 所处置的细胞必需是处于对数生长期同步生长的细胞，所处置的细胞必需是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀形状的单细胞悬液，将并且是均匀形状的单细胞悬液，将121121灭菌灭菌的无菌水参与到培育有链霉菌斜面的试管中，的无菌水参与到培育有链霉菌斜面的试管中，用接种环悄然刮下孢子，用接种环悄然刮下孢子，( (所处置的细胞必需是处于对所处置的细胞必需是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀形状的单细胞悬数生长期同步生长的细胞，并且是均匀形状的单细胞悬液，将含有孢子的无菌水转入三角瓶中，参与玻璃珠，液，将含有孢子的无菌水转入三角瓶中，参

2、与玻璃珠，在摇床上打碎，经滤膜过滤后即得到单孢子率在在摇床上打碎，经滤膜过滤后即得到单孢子率在9898以以上的单孢子悬液。上的单孢子悬液。目的：在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA的构造变异频率大幅度提高。 对诱变剂的敏感性高；对诱变剂的敏感性高； 具有特定消费性状的才干或潜力；具有特定消费性状的才干或潜力； 可采用划线分别法和稀释分别法进展纯化；可采用划线分别法和稀释分别法进展纯化； 该菌株变异幅度广；该菌株变异幅度广； 该菌株稳定性较好。该菌株稳定性较好。 选择物理诱变剂中非电离辐射即紫外线。选择物理诱变剂中非电离辐射即紫外线。 由于紫外线是一种运用时间长、效果好、由于紫外线是

3、一种运用时间长、效果好、设备简单、值得推行的诱变剂，大约有设备简单、值得推行的诱变剂，大约有80%80%的高产抗的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。 紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种 紫外线的作用机制是使两个嘧啶之间聚合，构成紫外线的作用机制是使两个嘧啶之间聚合，构成嘧啶二聚体，碱基不能正常配对。嘧啶二聚体，碱基不能正常配对。 紫外线诱变普通采用紫外线诱变普通采用15W15W紫外线杀菌灯，紫外线杀菌灯，波长为波长为253.7nm253.7nm，灯与处置物的间隔为，灯与处置物的间隔为151530cm30cm，照射时间依菌种而异，普通，照射时间依

4、菌种而异，普通为几秒至几非常钟。为几秒至几非常钟。 在诱变育种中有两条重要的实验曲线在诱变育种中有两条重要的实验曲线: : 剂量剂量- -存活率曲线存活率曲线 剂量剂量- -诱变率曲线诱变率曲线 经过比较以上两曲线，可找到剂量经过比较以上两曲线，可找到剂量- -存活率存活率- -诱变诱变率三者的最正确结合点。在实践任务中，突变率往往随率三者的最正确结合点。在实践任务中，突变率往往随剂量的添加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量反剂量的添加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量反而会使突变率降低。根据而会使突变率降低。根据UVUV、X X射线和乙烯亚胺射线和乙烯亚胺等诱变效应研讨结果，发现正变较多

5、地出等诱变效应研讨结果，发现正变较多地出如今偏低的剂量中，而负变较多地出如今如今偏低的剂量中，而负变较多地出如今偏高的剂量中。因此，在诱变任务中，大偏高的剂量中。因此，在诱变任务中，大多倾向于采用较低剂量致死率在多倾向于采用较低剂量致死率在70-70-80%80%。 1 1将细菌培育液以将细菌培育液以3000r3000rminmin离心离心5min5min，倾去上清液，倾去上清液，参与无菌生理盐水洗涤再离心。参与无菌生理盐水洗涤再离心。 2 2将菌悬液放入巳灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内用手将菌悬液放入巳灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液经过滤纸过滤，单细胞滤液摇动，以打散菌体

6、。将菌液经过滤纸过滤，单细胞滤液装入试管内，使细胞数约为装入试管内，使细胞数约为108108个个mlml，作为待处置菌悬，作为待处置菌悬液。液。 3 3取取2 24ml4ml制备的菌液加到直径制备的菌液加到直径7cm7cm培育皿内，放入培育皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W15W紫外线下紫外线下30cm30cm处。在正式照射前，应先开处。在正式照射前，应先开紫外灯预热紫外灯预热10min10min，然后开启皿盖正式在搅拌，然后开启皿盖正式在搅拌下照射下照射101050s50s。操作均应在红灯下进展，或。操作均应在红灯下进展，或用黑纸包住

7、，防止白炽光。用黑纸包住，防止白炽光。 4 4取未照射的制备菌液和照射菌液各取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml0.5ml进展稀进展稀释分别，计数活菌细胞数。释分别，计数活菌细胞数。 5 5取照射菌液取照射菌液2ml2ml于液体培育基中于液体培育基中(300ml(300ml三角瓶三角瓶内装内装30ml30ml培育液培育液) )，120r120rminmin振荡培育振荡培育4 46h6h。 6 6取中间培育液稀释分别、培育。取中间培育液稀释分别、培育。 7 7挑取菌落进展挑选。挑取菌落进展挑选。 1 1菌种遗传特性菌种遗传特性 各菌株因遗传特性不同，对诱变剂敏感性也不一各菌株因遗传特性不同，

8、对诱变剂敏感性也不一 样。样。 2 2菌体细胞壁构造菌体细胞壁构造 丝状菌孢子壁的厚度及外表的蜡质会妨碍诱变剂渗丝状菌孢子壁的厚度及外表的蜡质会妨碍诱变剂渗 入细胞。入细胞。 3 3环境条件的影响环境条件的影响 环境条件的影响包括：环境条件的影响包括： 诱变前预培育和诱变后培育诱变前预培育和诱变后培育 温度、温度、pHpH、氧气等外界条件对诱变效应的影响、氧气等外界条件对诱变效应的影响 由接种环以无菌操作沾取少许待分别的资料，由接种环以无菌操作沾取少许待分别的资料，在无菌平板外表进展平行划线、扇形划线或其在无菌平板外表进展平行划线、扇形划线或其他方式的延续划线，使链霉菌细胞数量将随着他方式的延

9、续划线，使链霉菌细胞数量将随着划线次数的添加而减少，并逐渐分散开来。假划线次数的添加而减少，并逐渐分散开来。假设划线适宜的话，能将链霉菌细胞一一分散，设划线适宜的话，能将链霉菌细胞一一分散，经培育后，可在平板外表得到单菌落。并测定经培育后，可在平板外表得到单菌落。并测定出其变异率变异数与察看总个体数的比值。出其变异率变异数与察看总个体数的比值。挑出变异菌落并移植至斜面上。挑出变异菌落并移植至斜面上。 分别后得到的菌落，真正能发生性能变好的所谓正突分别后得到的菌落，真正能发生性能变好的所谓正突变个数极少，要从几千万个菌落中选出几个好的，与变个数极少，要从几千万个菌落中选出几个好的，与自然选育中的

10、挑选方法一样。可分为初筛平板挑选、自然选育中的挑选方法一样。可分为初筛平板挑选、摇瓶发酵挑选摇瓶发酵挑选) )和复筛。和复筛。 挑选的方法：随机乱向挑选挑选的方法：随机乱向挑选 定向挑选定向挑选 突变是随机不定向的，但是挑选是定向的，培育基和突变是随机不定向的，但是挑选是定向的，培育基和培育条件是决议菌种某些特性保管或淘汰的培育条件是决议菌种某些特性保管或淘汰的“筛子。筛子。 初筛：以多为主，尽量扩展挑选范围。初筛：以多为主，尽量扩展挑选范围。 复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分别，复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分别，选育高产或其他优良菌株。选育高产或其他优良菌株。 多级程度挑选

11、：由于诱变产生高产突变株的频率很多级程度挑选：由于诱变产生高产突变株的频率很低，而且实、验误差又很难防止，所以挑选任务中低，而且实、验误差又很难防止，所以挑选任务中常用多级挑选，一利于优良菌株的获得常用多级挑选，一利于优良菌株的获得 平板菌落预筛平板菌落预筛 根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进展根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进展挑选和活性粗测的方法，大幅度扩展有效挑选量，提挑选和活性粗测的方法，大幅度扩展有效挑选量，提高挑选任务效率。高挑选任务效率。 摇瓶发酵挑选摇瓶发酵挑选 优点：不论种子或发酵过程的消费条件、生理条优点：不论种子或发酵过程的消费条件、生理条件如何，都与发酵罐大

12、消费条件相近，可以模拟进展。件如何，都与发酵罐大消费条件相近，可以模拟进展。缺陷：在突变率小的情况下，假设菌落挑缺陷：在突变率小的情况下，假设菌落挑取少，很难挑选到理想的突变株取少，很难挑选到理想的突变株 对初筛出来的菌株进展复筛时，通常采用摇瓶培对初筛出来的菌株进展复筛时，通常采用摇瓶培育法，普通一个菌株至少要反复育法，普通一个菌株至少要反复3535个瓶，培育后个瓶，培育后的发酵液必需采用准确分析方法测定。的发酵液必需采用准确分析方法测定。 复筛过程中，要结合各种培育条件进复筛过程中，要结合各种培育条件进展挑选，在不同培育条件下进展实验。展挑选，在不同培育条件下进展实验。 1 1、步骤：摇瓶

13、培育通常分为初筛和复筛，初筛因菌、步骤：摇瓶培育通常分为初筛和复筛，初筛因菌株多经常一株菌一瓶，进展振荡培育，培育终了后逐株多经常一株菌一瓶，进展振荡培育，培育终了后逐个进展活性测定，将消费性能高的菌株用沙土管或冷个进展活性测定，将消费性能高的菌株用沙土管或冷冻管保藏。复筛时取出，以一株冻管保藏。复筛时取出，以一株3-53-5瓶，振荡培育后，瓶，振荡培育后，测定活性，以提高准确性。测定活性，以提高准确性。 2 2、优点：培育条件与发酵罐接近，这样挑选出来的、优点：培育条件与发酵罐接近，这样挑选出来的菌容易在大消费中推行。菌容易在大消费中推行。3 3、本卷须知：摇瓶的条件要尽量与发、本卷须知：摇

14、瓶的条件要尽量与发酵罐接近。且各摇瓶间的培育条件要尽酵罐接近。且各摇瓶间的培育条件要尽量一致摇瓶型号，装量，瓶塞厚度或量一致摇瓶型号，装量，瓶塞厚度或瓶口包扎纱布的层数，摇床转数，温度瓶口包扎纱布的层数，摇床转数，温度培育基脂肪酶脂肪酶产生菌产生菌透明圈法透明圈法成色圈法成色圈法果胶酶果胶酶产生菌产生菌生长圈法生长圈法抑菌圈法抑菌圈法嘌呤产生菌嘌呤产生菌青霉素青霉素产生菌产生菌一、根据平板菌落生化反响挑一、根据平板菌落生化反响挑选变株选变株2037二、采用冷敏感菌挑选抗生素变株二、采用冷敏感菌挑选抗生素变株参与抗生素参与抗生素不加抗生素不加抗生素三、浓度梯度法挑选法三、浓度梯度法挑选法四、复印

15、技术快速挑选变株四、复印技术快速挑选变株测定不同酵母菌胞内脂肪含量的简单定量法测定不同酵母菌胞内脂肪含量的简单定量法苏丹黑染色1五、琼脂大通量挑选变株五、琼脂大通量挑选变株200摇瓶液体培育寥寥无几产物活性鉴定培育基培育条件调整正交实验设计 1. 1.琼脂平板活性圈法琼脂平板活性圈法 2. 2.纸片法纸片法: :发酵液浓度高时发酵液浓度高时 3. 3.琼脂薄层纸片法琼脂薄层纸片法 4. 4.自动生化仪器分析法自动生化仪器分析法透明圈透明圈变色圈变色圈生长圈生长圈抑菌圈抑菌圈( (水解酶、水解酶、有机酸有机酸 ( (产酸菌产酸菌) )(工具菌+待检菌)( (抗生菌抗生菌) ) 本组方案采用琼脂平

16、板活性圈法中的抑菌圈来测定其活性。 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体 野生型菌株野生型菌株wild type strain wild type strain 原始菌株原始菌株 营养缺陷型营养缺陷型auxotroph auxotroph 人工诱变或自然突变人工诱变或自然突变 原养型菌株原养型菌株prototroph prototroph 回复突变或重组变异回复突变或重组变异 与挑选营养缺陷型有关三类培育基与挑选营养缺陷型有关三类培育基 (1)(1)根本培育基根本培育基MMMM (2)(2)完全培育基完全培育基CMCM (3)(3)补充培育基补充培育基SMSM突

17、变株的表型 检出方法营养缺陷型 补充培育基auxotroph 抗性突变型 药物培育基resistant mutant条件致死型 培育条件改动conditional lethal mutant 诱发突变诱发突变 淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株 检出缺陷性检出缺陷性 鉴别缺陷性鉴别缺陷性 选择适宜的诱变剂与诱变方法选择适宜的诱变剂与诱变方法 诱变剂和诱变方法都要简便有效诱变剂和诱变方法都要简便有效 主要的诱变剂亚硝基胍主要的诱变剂亚硝基胍, ,紫外线紫外线, ,亚硝酸亚硝酸 诱变方法诱变方法 物理方法物理方法 化学方法化学方法 留意突变率还与诱变剂量有关留意突变率还与诱变剂量有关 1.抗生素法 青霉

18、素法细菌 作用于细菌细胞壁的主要成分肽聚糖 制霉菌法酵母菌 作用于真菌细胞膜上的甾醇 2.菌丝过滤法 适用于真菌和放线菌 作用于丝状菌的孢子 3.高温杀菌法 适用于芽孢菌类 作用于芽孢菌类的芽孢和营养体 夹 层 培 育 法 夹 层 培 育 法 限量补充培育限量补充培育法法 影 印 接 种 法影 印 接 种 法 逐个检出法逐个检出法 需求留意两点 第一 防止菌落分散和蔓延，在培育基中参与脱氧胆酸钠 第二 为了抑制孢子分散而带来不纯景象，在操作方法上改良。 1 、鉴定方法 一种方法是参与一种物质测定多株缺陷型菌株 一种方法是测定一种缺陷型菌株对许多生长因子的需求情况称为生长谱法 2、营养缺陷型鉴定步骤 1测定缺陷性菌株所需生长因子的类别 2详细测缺陷该类别物质中的哪种因子 3用单一因子进展复证实验 营养缺陷型生长