增强免疫力功能评价方法及修订说明

1、附件1：增强免疫力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1试验项目动物实验1.1.1 体重1.1.2 脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值1.1.3 细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4 体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5 单核巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验1.1.6 NK细胞活性测定2 试验原则所列的指标均为必做项目分为正常动物实验方案和免疫功能低下模型动物实验两种方案,可任选其一进行实

2、验.采用免疫功能低下动物模型实验方案时需做外周血白细胞总数测定3 结果判定采用正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性四个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定单核一巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，判定NK细胞活性结果阳性。正常动物实验需进行四个方面

3、的测性。采用免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，判性该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测性项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判性细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测性项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判性体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测性项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判性单核巨

4、噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定NK细胞活性结果阳性。血液白细胞总数测性的二个以上剂量结果阳性，可以判性血液白细胞总数结果阳性。免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测性。同时在各项实验中，任何一项测试都不出现加重免疫抑制剂作用的结果。增强免疫力功能检验方法MethodfortheAssessmentofEnhancingImmuneFunction1. 原理：免疫系统主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴组织和全身各处的淋巴细胞、抗原呈递细胞等，还包括血液中的白细胞。淋巴细胞经血液和淋巴使各处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体。胸腺属中央淋巴器官

5、，主要功能是确保T淋巴细胞的产生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细胞；脾脏对抗原发生免疫应答作用，脾窦的巨噬细胞具有清除功能，脾白髓含有记忆B细胞，产生对T依赖抗原的体液免疫应答。淋巴细胞是特异性免疫应答的主要细胞群，按其表面标志物，分为T细胞、B细胞和天然杀伤细胞（NKK三大类，T细胞又分为CD4（Th）细胞和CD8T淋巴细胞。B淋巴细胞转化为浆细胞后能合成和释放抗原特异抗体，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗体功能。免疫系统可产生特异性免疫和非特异性免疫功能，检测上述免疫系统的各种代表性指标的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判定。2. 实验动物选择

6、推荐用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，68周龄，1822g（BALB/C种可16-18g）,单一性别，雌雄均可，每组1015只。3. 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和1个阴性对照组。以人体推荐量的10倍为其中一个剂量，另设二个剂量组。必要时设阳性对照组。选做免疫低下模型法时，应设模型对照组。受试样品给予时间四周或30天。4免疫功能低下动物模型可选用环磷酰胺、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。造模原理：4.1.1 环磷酰胺主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤淋巴细胞，并可抑制淋巴细胞转化；环磷酰胺对B细胞的抑制比T细胞强，一般对体液免疫有很

7、强的抑制作用，对NK细胞的抑制作用较弱。4.1.2 氢化可的松主要通过与相应受体结合成复合物后进入细胞核，阻碍NF-kB进入细胞核，抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放，达到免疫抑制目的。氢化可的松还可损伤浆细胞，抑制巨噬细胞对抗原的吞噬、处理、和呈递作用，所以氢化可的松对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用。免疫抑制剂剂量选择环磷酰胺可选择40mgkg，腹腔注射，连续两天，末次注射给药后第5天测定各项指标；氢化可的松可选择40mgkg，肌内注射，隔天一次，共5次，末次注射给药后次日测定各项指标。各指标对两种模型敏感性不同，环磷酰胺模型比较适合抗体生成细胞检测、血清溶血

8、素测定、白细胞总数测定；氢化可的松模型比较适合迟发型变态反应、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK细胞活性测定，建议根据不同的免疫功能指标选择合适的模型。受试物给予连续给予受试物4周或30天，在第3周后开始给予免疫抑制剂，进行模型与预防性给药相结合的实验。5.实验方法血液白细胞数测定小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数检测方法（仪器法）全血用EDTAa抗凝后经血细胞分析仪检测，可测定白细胞数量，并可对白细胞进行分分类计数。5.1.1 仪器和材料乙二胺四乙酸二钾(EDTAK22H2Q),离心管，全血细胞分析仪上样管，眼科镊子，振荡器，加样枪，冷冻离心机，全血细胞分析仪。5.1.2 实验步骤

9、5.1.2.1 试剂配制血液抗凝：EDTA&能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，的EDTA&可阻止1ml血液凝固。抗凝剂配制：称量8mgEDTAK2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50屋抗凝剂可抗凝1ml小鼠全血。5.1.2.2 采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的离心管(或商品化的抗凝管)中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。5.1.2.3 检测分析上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数。上机操作

10、参照仪器说明书。5.1.3 数据分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，p>,结论：各组均数间差异无显著性意义；F值>，P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的白细胞总数显著高于阴性对照组，可判定该项实验结果阳性。ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验可任选下列方法之一5.2.1 MTT法5.2.1.1 原理当T淋巴细胞受ConAM激后发生母细胞增殖反应，

11、活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT（一种淡黄色的唾氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。5.2.1.2 仪器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-琉基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA、盐酸、异丙醇、MTTHank's液、PBSg冲液（）纱布、200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、大号注射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。5.2.1.3 实验步骤5.2.1.3.1 试剂配制完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10小牛血清，1谷氨酰胺（200mm

12、ol/L）,青霉素（100U/mD,链霉素（100ug/L）及5X105mol/L的2-琉基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHSpH至，即完全培养液。ConA液用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20C）保存。无菌Hank's液用前以的无菌NaHCOtl。MTT液将5mgMTW于1mL的PBS中，现配现用。酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mL1mol/L的HCl,临用前配制。5.2.1.3.2脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量（3-5ml）无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成

13、单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%Z上），调整细胞浓度为3X106个/mL。5.2.1.3.3淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL一孔加75仙lConA液（相当于Ng/mL）,另一孔作为对照，置5%CO,37cCO孵箱中培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液，加入不含小牛血清的RPMI1640W养液，同时加入MTT（5mg/mL50l/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性

14、异丙醇，超声震荡（2秒）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度计上在波长570nm测定ODfi。5.2.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的

15、，改用秩和检验进行统计。用加ConAfL的光密度值减去不加ConAfL的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。5.2.1.5 注意事项ConA的浓度很重要，浓度过低不能刺激足够的细胞增殖，浓度过高会抑制细胞增殖，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳浓度。5.2.2 XTT法5.2.2.1 原理由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，且溶解甲臜的有机溶剂有毒性，可选择XTT法替代MTT去。其原理是：XTT是二甲氧唾黄，在电子耦合试剂存在的情况下，活细胞线粒体中的脱氢酶可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲臜，生成的甲

16、臜能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶联免疫检测仪检测定吸光值。5.2.2.2 实验步骤脾细胞悬7制备同MTTt;淋巴细胞增殖反应：调整细胞浓度为5X107,取细月fi悬液100屋分别加入96孔培养板中，一孔加510NlConA液，另一孔作为对照，设2个平行孔，置37c5%CO饱和湿度孵箱中培养72h。培养结束前4h,向各孔中加入2050屋的XTT工作液(按试剂盒说明现用现配)，孵育4小时。用酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。5.2.2.3 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差

17、异无显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加ConAfL的光密度值减去不加ConAfL的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。5.2.2.4 注意事项细胞浓度及培养时间在实验前要预试，以找到最佳效果。5.2.3 溴脱氧尿嘧啶核苷标记酶联免疫吸附测定法(BrdU-ELISA法)5.2.3.1 原理T淋巴细胞在有丝分裂原ConA等的刺激下产

18、生增殖反应，BrdU可竞争掺入到增殖细胞中新合成的DNAg内，将BrdU标记的细胞作为抗原结合到固相载体表面，加入酶连接的抗-BrdU抗体，使BrdU抗原与酶标抗体充分结合，抗原抗体复合物与底物作用后产生有色物质，其光密度可反映细胞增殖的程度。5.2.3.2 仪器和材料低温离心机，全自动酶标仪、超净工作台、二氧化碳培养箱、96孔培养板（平底）、倒置显微镜、移液器、手术器械、200目筛网、细胞活性分析仪；RPMI1640细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS缓冲液（）、BrdU细胞增殖检测试剂盒（ELISA）、纯净水、终止液。5.2.3.3

19、实验步骤5.2.3.试剂配制完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol/L）,青霉素（100U/mD,链霉素（100Ng/L）及5X105mol/L的2-琉基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHMpH至，即完全培养液。ConA液用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20C）保存。无菌Hank's液用前以的无菌NaHCOtl。BrdU标记液将标记剂（试剂盒）按1:100的比例加到培养液中混匀，现配现用。抗体贮存液（母液）在Anti-BrdU-POD（试剂盒）中加双蒸水充分混合，存于-20备用

20、。抗体工作液每100屋抗体母液加10ml抗体稀释液（试剂盒），现配现用。洗液每10ml清洗缓冲液（试剂盒）加100ml双蒸水。5.2.3.脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应在95姒上），调整细胞浓度为2X107个/mL。5.2.3.淋巴细胞培养将细胞加入96孔培养板中，10仙1/孔，每份细胞加2孔，

21、第1孔再加入90N11640培养液，第2孔加入85仙11640培养液和世CConA同时设3个空白孔，每孔仅加100以11640培养液，置5%CO37c培养箱孵育72h,培养结束前4h加入BrdU标记液，10屋/孔，培养结束后离心（1000r/min,10min）,弃上清，吹干细胞，放4冰箱保存待测。5.2.3.酶联免疫吸附测定每孔加200屋固定液，常温放置30min后，吸弃固定液。加入100仙1BrdU抗体工作液，37c孵育60min；吸弃未结合的抗体，力口250屋洗液洗3次，轻拍移去洗液。加底物溶液（含TMB1001/孔，常温孵育15min。用酶标仪测量吸光值，不加终止液时，测定发射波长为3

22、70nm（记为乐。），参考波长492nm（记为A92）；加终止液时，测定发射波长为450nm（记为性。），参考波长690nm（记为A690）。5.2.3.4数据处理及结果判定计算每孔标记指数（LI）,LI=（A370-A空白370）-A492-A空白492）或LI=（A450-A空白450）-（A690-A空白690）。用加ConA孔的LI值减去不加ConA孔的LI值所得的差值代表淋巴细胞的增殖程度。采用方差分析对标记指数差值进行统计学分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,则各组均数间差异无显著性；F值,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的

23、两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的LI值差值显著高于对照组的LI值差值，可判定该项实验结果阳性。5.2.3.5注意事项选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度迟发型变态反应（DTH）迟发型变态反应是细胞免疫的体内检测法，当致敏T细胞再次与抗原接触，引起T细胞活化，释放出多种细胞因子，致局部组织发生以单核细胞为主的炎症反应，一般在2448h达高峰。可任选下

24、列方法之一试验。5.3.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH（耳月中胀法）5.3.1.1 原理二硝基氟苯（DNFB）稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。47d后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部月中胀，一般在抗原攻击后2448h达高峰，其月中胀程度可以反映迟发型变态反应程度。5.3.1.2 材料DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。5.3.1.3 实验步骤5.3.1.3.1 试剂配制DNFB§液DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1:1）,倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用

25、250屋注射器通过瓶盖取用。5.3.1.3.2 致敏每鼠腹部皮肤用硫化钢脱毛，范围约3cmX3cm用DNFB溶液50屋均匀涂抹致敏。5.3.1.3.3 DTH的产生与测定5天后,用DNFB溶液10仙1均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mml勺耳片，称重。5.3.1.4 数据处理与结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正

26、态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。5.3.1.5 注意事项：操作时应避免DNFBW皮肤接触。5.3.2 绵羊红细胞（SRBC诱导小鼠DTH（足跖增厚法）5.3.2.1 原理SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBCC击时，攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。5.3.2.2 仪器与材料游标卡尺（精密度0.02mm、SRBC微量注射器（50膜）、足趾容积测量仪。5.3.2.3 实验步

27、骤5.3.2.3.1 致敏小鼠用2%（v/v）SRBC腹腔或静脉免疫，每只鼠注射（约1X108个SRBC）。5.3.2.3.2 DTH的产生与测定免疫后4天，测量左后足跖部厚度或肿胀度，然后在测量部位皮下注射20%（v/v）SRBC,每只鼠20屋（约1X108个SRBC,注射后于24h测量左后足跖部厚度或肿胀度，同一部位测量三次，取平均值。测量方法：用游标卡尺测量肉眼读数。或用足趾容积测量仪进行测量足跖部肿胀度，操作方法按仪器操作指引进行。5.3.2.4 数据处理和结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无

28、显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。5.3.2.5 注意事项前后两次测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。攻击时所用的SRB翌新鲜（保存期不超过1周）。抗体生成细胞检测（改良法）5.4.1 原理溶血空斑试验是检测产生IgM、IgG等抗体分泌细胞数体

29、外试验法。用绵羊红细胞（SRBC免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC昆合，在补体参与下，使抗体分泌细胞周围的SRBCS解，形成肉眼可见的空斑。5.4.2 仪器和材料溶血空斑自动图象分析仪、二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、200目筛网、SRBC补体（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640W养液、SA缓冲液（C4H4N2O30.46g,MgCl20.1g,0.2g,NaCl8.38g,NaHC3O0.252gandC8H11N2NaO30.3g,加蒸馏水至1000mL）、灭菌生理盐水、琼脂糖。5.4.3 实验步骤：5.4.3.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃

30、珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，生理盐水2500rpm/min,15min,洗涤3次，制备压积SRBC放入4c冰箱保存备用。5.4.3.2 完全培养基的制备：新生小牛血清经绵羊红细胞（v/v，5：1）吸收，4，30-60min后，加入不完全培养基RPMI1640中，制备成含20%小牛血清的完全培养基。5.4.3.3 补体制备股动脉取血，静置30-60min，2500rpm/min，15min分离5.4.3.4血清，将5-10只豚鼠血清混合后，与压积SRBCZ5:1（v/v）比例混合，4c冰箱放置30-60min,问或震荡，2500rpm/min,15min分离血清，分装，-80C冰

31、箱保存。用时以完全培养基1：10（v/v）比例稀释。免疫动物压积SRBC以生理盐水制成2%（v/v）的细胞悬液（约1X108个SRBC,每只鼠腹腔注射。5.4.3.5 脾细胞悬液制备将SRBQfe疫4-5天后的小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾脏，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液，200目筛网过滤，1000rpm/min,10min,去上清，Hank'液洗2遍，以完全培养基RPMI1640制备成5X1061X107个细胞/mL的脾细胞悬液。5.4.3.6 空斑的测定5.4.3.6.1 底层培养基制备0.5g琼脂糖加入100mL灭菌生理盐水中，加热溶解，待温

32、度于50c左右时，以1mL仇的量加至六孔培养板中，琼脂凝固后备用。5.4.3.6.2 顶层培养基制备0.5g琼脂糖加入100mLHanks液中（）,加热溶解，以试管的量加至46-50恒温的试管中。5.4.3.6.3 铺板：50屋20%SRBC生理盐水配制，v/v）、200屋脾细胞悬液先后加入含有顶层的试管中，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液，每个样本做两个平行孔。5.4.3.6.4 空斑测定：已制备好培养板放入37C、5%CO加养箱中孵育1h,然后每孔加入500屋以完全培养基稀释的补体（v/v,1:10）,继续孵育2h,自动图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数

33、的平均值为样本的溶血空斑数值，以空斑数/106脾细胞表示。5.4.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。血清溶血素的测定可任选下列方法之一。5.5.1

34、 血凝法5.5.1.1 原理用SRBCfe疫动物后，产生抗SRBCG体(溶血素)，利用其凝集SRBC勺程度来检测溶血素的水平。5.5.1.2 仪器和材料SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机5.5.1.3 实验步骤5.5.1.3.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存2周。5.5.1.3.2 免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBCffl生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射进行免疫。45d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h,将凝固血与

35、管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min,收集血清。5.5.1.3.3 凝集反应用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100仙1,再加入100仙l%(v/v)的SRB喝液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37c温箱孵育3h,观察血球凝集程度。5.5.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换

36、后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。血清凝集程度一般分为5级(0-IV)记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。抗体水平=(Si+2S+3&nS)式中1、2、3n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。0级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。I级红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。R级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。田级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。I

37、V级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。5.5.1.5 注意事项血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。5.5.2 半数溶血值（HG）的测定5.5.2.1 原理用SRBC&疫动物后，产生抗SRBCM体（溶血素），在补体参与下，与SRBC一起孵育，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。5.5.2.2 仪器和材料分光光度计、全自动酶标仪、恒温培养箱、96孔培养板、离心机、恒温水浴、SRBC补体（豚鼠血清）、SA缓冲液（CHNQ0.46g,MgC20.1g,0.2g,NaCl8.38g,NaHCOO.252gandGH

38、iNNaOOFg,加蒸储水至1000mL、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氟化钾0.2g、氟化钾0.05g,加蒸储水至1000mL5.5.2.3实验步骤5.5.2.3.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存2周。5.5.2.3.2 制备补体采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBO入到5mL豚鼠血清中，放4c冰箱30min,经常振荡，离心取上清，分装，70c保存。用时以SA缓冲液按1:8稀释。5.5.2.3.3 免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10m

39、in。将压积SRBCffl生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射进行免疫。45d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h,使血清充分析出，2000r/min离心10min,或6000r/min,4min,收集血清。5.5.2.3.4 溶血反应测定5.5.2.3. 检测方法1（分光光度计测定）：取血清用SA缓冲液稀释（一般为200500倍）。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%（v/v）SRBC,补体1mL（用SA液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA液代替）。置37恒温水浴中保温1530min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL加都氏试

40、剂3mL同时取10%（v/v）SRBC加都氏试剂至4mL充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。5.5.2.4. 检测方法2（全自动酶标仪测定）：设样品孔和空白对照孔，样品孔：取血清10仙1,用1mL1:5稀释的SA缓冲液稀释；每孔加入稀释后的血清100履；空白对照孔：每孔加入100屋1:5稀释的SA缓冲液，再依次加入10%（v/v）SRBC50屋，补体100膜（用SA溶液或PBS容液按1:8稀释），置37c恒温水浴中保温30min,1500r/min离心10min。然后样品孔和空白对照孔各取上清液50加入另一个96孔培养板内，加都氏试剂150仙1。同时

41、设半数溶血孔，加入10%（v/v）SRBC屋，再加都氏试剂至200屋。用震荡器充分混匀，放置10min后，于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。5.5.2.5. 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。溶血素的量以半数溶血值（HQ）表示，按下列公式计算：样品光密

42、度值X稀释倍数样品HC50=SRBC半数溶血时的光密度值样品光密度值-空白光密度值或样品HC5o=X稀释倍数SRBC半数溶血时的光密度值-空白光密度值受试样品组的HQ显著高于对照组的HQ,可判定该项实验结果阳性。小鼠碳廓清实验5.6.1 原理在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系。以血碳浓度对数值为纵座标，时间为横座标，两者呈直线关系。此直线斜率(K)可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬指数a表示。5.6.2 仪器和试剂分光光度计、全自动酶标仪、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO35.6.3 实验步骤5.6.3.1 溶液配制注射用墨汁将印度墨汁原液用生理

43、盐水稀释34倍。Na2CO溶液取，加蒸储水至100mL5.6.3.2 注射墨汁称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重计算。待墨汁注入，立即计时。5.6.3.3 测定注入墨汁后2、10min,分别从内眦静脉丛取血20小，并立即将其加到2mL%N2CO溶液中。用分光光度计或全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD,以NaCO溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a：K=lgOD1-lgOD2体重3吞噬指数a=xJK肝重十脾重5.6.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先

44、进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无显著性；F值,P0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。5.6.5 注意事项静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。使用新的墨汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在2030min内不易廓清。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧

45、光微球试验方法5.7.1 原理：激活的巨噬细胞具有吞噬表面带有阳性可调理基团的荧光微球，将含有巨噬细胞的腹腔液与调理过的荧光微球孵育一定时间后，去除多余未被吞噬的微球，收集以巨噬细胞为主的标本，用流式细胞仪检测巨噬细胞，计数吞噬荧光微球的巨噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。5.7.2 仪器和材料Hank's液，小牛血清，PB或冲液，生理盐水，荧光微球（2m）,1%小牛血清白蛋白（BSA。流式细胞仪，超声清洗仪，二氧化碳细胞培养箱，离心机，6孔培养板，细胞刮，过滤器（75mj）,流式上样管，流式细胞仪专用鞘液，移液枪及吸头，白细胞计数板，手术器械一套，注射器，

46、滴管，胶头吸管。5.7.3 实验步骤5.7.3.1 试剂配制5.7.3.1.1 含5%小牛血清的Hank's液：取10ml小牛血清加入200mlHank's液中，混匀，临用前配。5.7.3.1.2 PBS缓冲液的配制方法：KHPO6.66g,NaHPO12HO6.38g,将上述试剂溶于1000ml蒸储水中调PH值至即成。5.7.3.1.3 2%绵羊红细胞悬液的配制方法：实验前取绵羊颈静脉血，置于盛有玻璃珠（20个左右）的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动510分钟，除去纤维蛋白，用生理盐水洗涤3次，每次1500rPm,离心10分钟，4c冰箱保存。实验前弃去上清，按血球压积用生理盐

47、水配制成2%的红细胞悬液。5.7.3.1.4 1%BSA勺配制：溶于50mlPBSg冲液中，临用前配较好。5.7.3.1.5 荧光微球预调理：100屋荧光微球与10ml1%BSA37c避光孵育30min,超声处理5min,临用前配。5.7.3.2 腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球过程实验前4天给每只小鼠腹腔注射2%绵羊血红细胞激活小鼠巨噬细胞，实验当天用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液3ml/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2ml用75m过滤器过滤至试管内，调整巨噬细胞数为46X105/ml。用移液枪吸取1ml腹腔洗液于

48、6孔培养板中,加入已经预调理过的荧光微球（1X107/板），37c二氧化碳细胞培养箱（或室温）避光孵育90120分钟，孵育结束后弃上清（含未贴壁细胞和多余荧光微球），每次使用缓冲液轻轻洗涤2次，去上清后再加入4CPBS缓冲液，用细胞刮刮下贴壁细胞，轻轻吹打均匀后经75m过滤器过滤后上机分析。5.7.3.3 流式细胞仪检测分析5.7.3.3.1 设门：首先设立FSC-SS5维散点图，通过调节FSC?口SSC电压值，以巨噬细胞设门界定分析的巨噬细胞群，最大限度地排除其它有核细胞、细胞碎片等的干扰;573.3.2获取：在荧光微球发射光的荧光通路检测巨噬细胞的荧光强度，每份样本获取5000个巨噬细胞，

49、数据可显示于二维散点图和直方图中。在二维散点图中可通过设门圈定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群；在直方图中可通过标尺标定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群，全部数据经相关软件分析未吞噬荧光微球的巨噬细胞和吞噬不同数量荧光微球的巨噬细胞的比例。吞噬一个荧光微球吞噬二个荧光微球图1吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞图（荧光显示400）图2吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FSC-SS。口FL2-SSC二维散点图R1:总巨噬细胞群R2:未吞噬荧光微球的巨噬细胞群R3:吞噬一个荧光微球的巨噬细胞群R4：吞噬两个光微球的巨噬细胞群R5:吞噬三个荧光微球的巨噬细胞群R6:

50、吞噬四个或四个以上荧光微球的巨噬细胞群图3吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FL2直方图5.7.4 数据处理及结果判定吞噬荧光微球的巨噬细胞数吞噬百分率（衿=X100计数的巨噬细胞数被吞噬的荧光微球总数吞噬指数=计数的巨噬细胞数以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，X=Sin-1JP，式中P为吞噬百分率，用小数表示，然后再进行方差分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F®<,结论：各组均数间差异无显著性；F值,p0,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当

51、的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较，差异均有显著性，可判定该项实验结果阳性。5.7.5 注意事项5.7.5.1 颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管破裂出血，导致腹腔洗液中混杂大量红细胞，影响流式细胞仪的结果分析。5.7.5.2 孵育、细胞洗涤和上机全程注意避光，以保持微球荧光稳定性。5.7.5.3 巨噬细胞、荧光微球浓度要根据试剂说明书调整合适，否则影响结果准确性。5.7.5.4 细胞处理过程要轻柔，尽量减少碎片和杂质对结果分析的影响

52、。5.7.5.5 腹水细胞上机前一定要用足够标准的滤器过滤，调理后多余的荧光微球要尽量去除，以防止流式细胞仪堵塞。NK细胞活性测定NKffl胞是没有T和B细胞表面标志的淋巴细胞，具有非特异性杀伤作用。可任选下列方法之一测定。5.8.1 乳酸脱氢酶（LDH测定法5.8.1.1 原理正常情况下，活细胞的胞浆内含有的LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDHS放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NADS®成NADH后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT接受U被还原成紫红色甲月赞类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。5.8.1.2

53、 仪器和材料酶标仪、全自动细胞计数仪、YAC-1细胞、Hank's液（）、RPMI164沈全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NADL的Tris-HCl缓冲液（）、1%NP40或Triton5.8.1.3 实验步骤5.8.1.3.1 LDH基质液的配制乳酸锂5x10-2mol/L硝基氯化四氮唾（INT）x10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸盐（PMSX10-4mol/L氧化型辅酶I（NADX10-3mol/L将上述试剂溶于L的Tris-HCl缓冲液中（）5.8.1.3.2 靶细胞的传代（YAC-1细胞）实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以H

54、ank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4X105个/mL。5.8.1.3.3 脾细胞悬液的制备（效应细胞）无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，力口入灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入倍Hank's液及8mLHanks液，1000rpm,10min离心，然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞；或用1mL含10%、牛血清的RP

55、MI164沈全培养液重悬，用1麻醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%Z上），用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%Z上）,最后用RPMI1640I全培养液调整细胞浓度为2X107个/mL。5.8.1.3.4 NK细胞活性检测取靶细胞和效应细胞各100仙l（效靶比50:1）,加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100仙l,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40或Triton各100卜l;上述各项均设三个复孔，于37C、5%CO培养箱中培养4h,然后将96孔培养板以1500r/min离心5min,每孔吸取上清100口置平底96孔培养板中，同时加入LDHS质液100仙l,反应3mi

56、n,每孔加入1mol/L的HCl30小，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD。按下式计算NK细胞活性：反应孔Ot>自然释放孔ODNK细胞活性=X100%最大释放孔OD-自然释放孔OD5.8.1.4 数据处理及结果判定NK细胞活性需进彳T数据转换，X=Sin-1行，式中P为NKffl胞活性，用小数表示，然后再进行方差分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<,结论：各组均数间差异无显著性；F<>,P<,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求

57、后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。5.8.1.5 注意事项靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95比色时环境温度应保持恒定LDH基质液应临用前配制在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。5.8.2同位素3H-TdR测定法5.8.2.1 原理将用同位素3H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反应NKffl胞的活性。5.8.2.2 仪器和材料液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、3H-TdRRPMI1640完全培