水溶性桥联双卟啉与DNA相互作用的研究

1、2007年第65卷第22期, 25972603化 学 学 报ACTA CHIMICA SINICAVol. 65, 2007 No. 22, 25972603* E-mail: zyliwucReceived January 25, 2007; revised May 20, 2007; accepted July 2, 2007. 国家自然科学基金(No. 20672082)资助项目.2598化 学 学 报 Vol. 65, 2007光敏剂Photofrin就是一个卟啉低聚体的混合物, 含有2至8个卟啉单元10. 目前, 关于双卟啉化合物与DNA相互作用的研究报道较少9b,11. 我们合成了

2、以4,4'-二羧 酸-2,2'-联吡啶为桥联试剂、包含有8个阳离子的水溶性双卟啉(PD). 以报道最为广泛的5,10,15,20-四(4-N-甲基吡啶盐)卟啉(H2TMPyP)为参照物, 研究了该双卟啉与CT DNA的相互作用、结合常数、结合模式及其对质粒DNA的切割能力.SOCl2 (2 mL)置于50 mL反应瓶中, 回流反应3 h后, 减压蒸除过量的SOCl2. 向此瓶中加入110.7 mg (0.175 mmol) 5-(4-氨基苯基)-10,15,20-三吡啶基卟啉, 15 mL精制氯仿和0.3 mL三乙胺, 70 下反应18 h. 反应液浓缩后, 进行柱层析分离,

3、以硅胶为固定相, 氯仿/甲醇混合溶剂作淋洗剂, 收集主要组分, 氯仿/石油醚重结晶后得紫色固体45.1 mg, 产率40%. UV-vis (CHCl3) : 420, 517, 553, 594, 652 nm; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) : 9.06 (s, 2H, Py3), 9.059.02 (m, 16H, H), 8.94 (d, J8.1 Hz, 4H, CONH-Phm), 8.90 (d, J6.0 Hz, 2H, Py6), 8.83 (d, J5.7 Hz, 12H, Por-Pyo), 8.67 (d, J6.6 Hz, 2H, Py5), 8.2

4、4 (d, J8.1 Hz, 4H, CONH-Pho), 8.13 (d, J5.7 Hz, 12H, Por-Pym), 2.85 (s, 4H, pyrrole-H)(其中, Por-Pym和Por-Pyo表示与卟啉环相连的吡啶环上的两个质子, 下文均同). IR (KBr) : 1654 (CONH) cm1; MS (FAB) m/z: 1472 M1.1.2.2 双卟啉化合物PD的合成14.7 mg (0.01 mmol)双卟啉化合物1溶于DMF (5 mL)中, 加入CH3I (2 mL, 大大过量), 室温下搅拌, 反应3 h. 减压蒸出CH3I和DMF, 残余物溶于少量DMF

5、中, 加入乙醚沉淀. 离心, 倾去上层溶液, 固体反复用乙醚洗涤、离心. 真空干燥, 收集紫色固体得24.5 mg, 产率94%. 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) : 11.24 (s, 2H, Py3), 9.479.45 (m, 16H, H), 9.19 (brs, 6H, CONH-Phm, Py6), 9.11 (brs, 12H, Por-Pyo), 9.008.97 (m, 6H, Py5, CONH-Pho), 8.18 (brs, 12H, Por-Pym), 4.70 (s, 24H, CH3), 2.99 (s, 4H, pyrrole-H); MS

6、(FAB) m/z: 1594 M8I. 1.3 卟啉产生单线态氧能力的测定卟啉和DPBF溶于Tris-HCl缓冲液中, 使卟啉浓度为1 µmol/L, DPBF为100 µmol/L. 取3 mL上述溶液至比色皿中, 高压汞灯照射(距样品15 cm), 用紫外分光光1 实验部分1.1 试剂与仪器所有用于化学合成的试剂、溶剂均为商业购得并使用标准方法纯化. 柱层析硅胶由青岛海洋化工厂生产, 粒度为200300目. 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液: pH7.4, 0.05 molL1 Tris-HCl, 0.1 molL1 NaCl; 小牛胸腺DNA, p

7、BR322质粒DNA、溴化乙啶(EB)购自华美生物工程公司; 1,3-二苯基异苯唑呋喃(DPBF)购自Acros公司.Shimadzu UV-1601型紫外-可见光谱仪; Perkin Elmer LS-55荧光光谱仪; JASCO J-810圆二色谱仪; Shimadzu FT-IR 3000红外光谱仪(KBr, cm); Bruker ARX-300 (300 MHz)核磁共振波谱仪; TSQ 7000质谱仪; DYY-8B稳流稳压电泳仪; GHg-50A高压汞灯(50 W); Vilber Lourmat Bio Print凝胶成像分析系统. 1.2 合成5-(4-氨基苯基)-10,15

8、,20-三吡啶基卟啉参照文献12的方法合成, 双卟啉化合物1和PD合成路线见Scheme 1.1.2.1 双卟啉化合物1的合成将18.3 mg (0.075 mmol) 4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶和1Scheme 1No. 22王 凯等：水溶性桥联双卟啉与DNA相互作用的研究2599度计测量随时间变化的溶液在415 nm处吸光度的值. 以时间为横坐标、不同时间的吸光度为纵坐标作图, 比较其产生单线态氧的能力.1.4 卟啉与CT DNA相互作用的光谱所有光谱测定均于室温下在Tris-HCl缓冲液中进行. 在260 nm使用吸光系数1.31×104 mol1cm1

9、L来测定CT DNA的浓度. 1.4.1 紫外-可见光谱卟啉浓度为2 µmol/L, 用CT DNA进行滴定, 记录380520 nm之间的光谱变化. 1.4.2 荧光光谱卟啉浓度为1 µmol/L, 用CT DNA进行滴定, 激发波长为422 nm, 发射波长为652 nm, 记录550750 nm之间的光谱变化. 1.4.3 圆二色谱卟啉浓度为10 µmolL1, CT DNA浓度为0, 200 µmolL1进行测量(r0, 0.05), 记录380520 nm之间的光谱变化.1.5 卟啉与CT DNA的表观键合常数的测定表观键合常数的测定采用EB竞

10、争法, 室温下在Tris-HCl缓冲液中进行, 实验条件下EB与CT DNA的结合常数为5.93×105 Lmol1. 在540 nm激发, 610 nm发射下, 分别测量自由EB、EB插入DNA、在卟啉存在下EB插入DNA的荧光强度变化. 1.6 卟啉切割pBR322质粒DNA的测定pBR322质粒DNA (1.0 µg)分别和不同浓度的卟啉(2.0 or 0.5 µmolL1)混合使其总体积为10 µL(在Tris- HCl缓冲液中进行). 在恒温37 下用高压汞灯50 W光照此混合液12 min(灯距离样品15 cm), 使卟啉作用于DNA. 停止

11、光照后加1 µL溴酚蓝, 经0.9%琼脂糖凝胶电泳. 凝胶以EB溶液染色30 min, 经清水冲洗后放入成像系统观察结果并照相.渐氧化分解, 它在415 nm处吸收峰的吸收值也逐渐降低, 其吸收值的变化正比于DPBF的含量. 因此通过检测DPBF在卟啉存在下光照时的分解速率可以鉴定卟啉产生单线态氧的能力, 其曲线的斜率就代表了产生单线态氧的能力.如图1所示, PD和H2TMPyP产生单线态氧的能力没有明显区别, 因此这两种化合物光切割DNA的能力只与它们和DNA相互作用的亲和力和模式有关.图1 在PD和H2TMPyP作用下DPBF的分解率(a)和化合物H2TMPyP的结构(b)Fig

12、ure 1 Decomposition of DPBF by PD and H2TMPyP (a) and the structure of H2TMPyP (b)2.2 卟啉与CT DNA相互作用的光谱性质卟啉与CT DNA相互作用的光谱数据分别列入表1中.2.2.1 紫外-可见光谱性质卟啉化合物具有共轭大环结构, 存在紫外可见吸收特征光谱, 因此紫外-可见光谱常被用来研究卟啉与DNA的相互作用14. 当卟啉化合物插入DNA后, 其大环上电子云密度受DNA碱基上电子云的影响而降低, 在紫外-可见光谱中表现为Soret带红移(大于10 nm)且减色(大于35%); 若卟啉化合物仅在DNA表面上

13、聚集时, 卟啉环受DNA的影响较小, 吸收光谱变化甚微8.2 结果与讨论2.1 卟啉产生单线态氧能力的测定卟啉化合物在光照后能够切割DNA是由于在光照过程中产生了高能的单线态氧. 为了探讨卟啉切割DNA的能力, 首先检测卟啉产生单线态氧的能力.1,3-二苯基异苯唑呋喃(DPBF)是一种优良的单线态氧捕捉剂13, 其作用机理是光作用下卟啉产生的单线态氧可以将DPBF氧化成二苯甲酰基苯. 随着DPBF的逐2600化 学 学 报表1 卟啉与CT DNA相互作用的对比数据Table 1 Compared data of the interaction of porphyrins with CT DNA

14、Vol. 65, 2007PorphyrinUV-vis on the Soret bandHypochromicity H/% Red shift /nm Decrease of intensity/%10 37Fluorescence emissionCD in the Soret regionPositive band/nmNegative band/nmKapp/(Lmol1)PD 37 H2TMPyP 399 21445 426 1.2×106 6.9×106紫外-可见滴定按照文献15报道的方法进行, 结果如图2所示. 随着CT DNA的加入, 卟啉的Soret带

15、出现红移和减色. 这表明卟啉与CT DNA发生了强烈的相互作用. 双卟啉Soret带的最大红移达到9 nm, 最大减色达到37%. 两种卟啉与CT DNA作用的相关数据列入表1中.谱(最大猝灭)如图3所示, 其数据列于表1中.图3 不存在(实线)和存在(虚线)CT DNA的条件下阳离子卟啉的荧光发射光谱Figure 3 Fluorescence emission spectra of cationic porphyrins in the absence () and presence (····) of CT DNA图2 CT DNA滴定阳离子卟啉的紫外

16、-可见吸收变化 Figure 2 UV-vis absorbance change when titration of cationic porphyrins by CT DNAaPD; bH2TMPyPaPD; bH2TMPyP2.2.3 圆二色谱性质圆二色谱是研究小分子与DNA相互作用的有力而简便的方法17. 在Soret区, 非手性卟啉和DNA都没有CD光谱, 但在DNA的诱导下, 卟啉化合物在此区域产生特征的诱导圆二色谱(ICD). 诱导圆二色谱与卟啉和DNA的相互作用模式密切相关18. 正的ICD峰表示外部结合, 负的ICD峰代表插入19.在PD/DNA base pairs不同条件

17、下(比率r为0或0.05), 双卟啉PD的诱导圆二色谱如图4所示, 相关数据列于表1中.不加入CT DNA时, 卟啉没有CD峰产生. 当PD/ DNA base pairs为0.05时, 445 nm处出现一个强烈的正峰, 426 nm处出现一个较弱的负峰. 结合紫外-可见光谱中观察到的红移和减色效应以及荧光光谱中的荧光强度2.2.2 荧光光谱性质荧光光谱是研究小分子与DNA相互作用的主要手段. 当卟啉化合物插入DNA后, 卟啉分子受到DNA有序碱基对的屏蔽, 减少了与溶剂分子的碰撞, 增大了荧光强度. 若卟啉大环不能与DNA结合, 卟啉环与DNA之间的碰撞会降低卟啉化合物的荧光强度16.在荧

18、光光谱测试中, 当CT DNA滴加到卟啉溶液中, 最初荧光强度减弱; 随着CT DNA的逐步加入, 荧光强度增加. 在CT DNA不存在和存在下的荧光发射光No. 22王 凯等：水溶性桥联双卟啉与DNA相互作用的研究2601减弱, 双卟啉PD与CT DNA的结合应为插入和外部结合的混合模式. 这样的结果与双卟啉的分子构型有关.图5 卟啉与EB竞争键合CT DNA的Scatchard图图4 PD键合CT DNA的诱导园二色谱Figure 4 Induced CD spectra of PD bound to CT DNAr0, 0.05r代表每摩尔DNA结合的EB摩尔数, c代表游离EB浓度Fi

19、gure 5 Competition between porphyrins and EB for the bind-ing site of CT DNA (Scatchard plot)r is the number of moles of EB bound per mole of DNA, c is the concentration of free EB.2.3 卟啉与CT DNA的表观键合常数紫外和荧光滴定曾用于测量药物与DNA的结合常数20, 但这两种方法有严重的局限性8. 本文采取EB竞争法测量卟啉与DNA的结合常数21. EB本身的荧光很弱, 但嵌入双螺旋DNA碱基对后, 荧光强度

20、显著增强. 若在EB-DNA体系中加入小分子化合物也能与DNA发生类似EB的嵌入作用, 该小分子化合物会与EB竞争结合DNA, 因此这种方法可以测量所有与DNA有亲和力的化合物, 不论其与DNA的结合方式如何, 它只是测量化合物阻止EB插入DNA的能力.当EB与DNA相互作用时, 游离的和结合的EB之间的平衡可由Scatchard方程21来表述:DNA的能力远大于双卟啉PD, 其结合常数是双卟啉的五倍. 造成这个结果的原因是卟啉对DNA的不同结合模式所致, PD与CT DNA以一种含有插入和外部结合的混合模式相互作用, H2TMPyP与DNA的结合模式为插入, 而插入模式的结合强度远大于外部结

21、合8. 双卟啉分子结构中的酰胺键增强了其电负性, 导致其对DNA的亲和力较弱. 此外, 双卟啉分子应为线性构型22, 如下图所示.rEBKEB(nrEB) cEB当EB与卟啉竞争DNA的结合位点时, Scatchard方程可以描述为21:图6 PD的线性分子结构图Figure 6 Linear molecular structure of PDrEBKEB(nrEB) cEB1Kappcpor式中, KEB和Kapp分别为EB和卟啉各自对DNA的结合常数, cEB和cpor分别为自由EB和自由卟啉的浓度, rEB是每个核苷酸结合的EB分子数, n是每个核苷酸上可结合的EB分子数(位点数). 由

22、此等式可得卟啉的结合常数(Kapp).在含有阳离子卟啉的条件下, EB键合CT DNA的Scatchard图如图5所示, 相应直线的斜率代表了不同卟啉对CT DNA的结合常数, 相关数据列于表1中.在我们的设计中, 卟啉对DNA的亲和力应随阳离子数目的增加而增强8. 实验结果显示, H2TMPyP结合线状的分子结构使得双卟啉与DNA相互作用时只有一个包含有三个阳离子的卟啉环可以插入DNA中, 影响了化合物对DNA的亲和力. 为证实这个结论, 进行了这两个卟啉化合物对质粒DNA的光切割实验. 2.4 卟啉切割pBR322质粒DNA的能力图7分别是两种卟啉在不同浓度下切割超螺旋pBR322 DNA

23、的实验结果.从图7的结果可以看出, 不存在卟啉时, 不论有无光照DNA都没有被切割现象(lane 1, 2), 说明DNA的切割源于卟啉的作用; 存在卟啉没有光照时也没有被切割现象(A中lane 3, 5), 这说明在光照条件下卟啉产生的单线态氧才是导致DNA切割的真正原因.2602化 学 学 报 Vol. 65, 2007References1 (a) Uno, H.; Masumoto, A.; Ono, N. J. Am. Chem. Soc.2003, 125, 12082.(b) Kubo, Y.; Ishii, Y.; Yoshizawa, T.; Tokita, S. Chem.

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25、, D.; Kobuke, Y. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 4612. 2 Ema, T.; Nemugaki, S.; Tsuboi, S.; Utaka, M. TetrahedronLett. 1995, 36, 5905.3 Gust, D.; Moore, T. A.; Moore, A. L. Pure Appl. Chem.1998, 70, 2189.4 Wanger, R. W.; Lindsey, J. S.; Seth, J.; Palaniappan, V.;Bocian, D. F. J. Am. Chem. Soc. 1996, 11

26、8, 3996.5 Brandon, E. J.; Kollmar, C.; Miller, J. S. J. Am. Chem. Soc.1998, 120, 1822.6 Anderson, H. L.; Martin, S. J.; Bradly, D. C. Angew. Chem.,Int. Ed. Engl. 1994, 33, 655.7 (a) MacDonald, I. J.; Dougherty, T. J. J. PorphyrinsPhthalocyanines 2001, 5, 105.(b) Zupán, K.; Herényi, L.; T&#

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31、Chem. 1997, 36, 1676.图7 两种卟啉对超螺旋pBR322 DNA的剪切10 µL反应液中含有1.0 µg质粒DNA, 光照时间为12 minFigure 7 Cleavage of supercoiled pBR322 DNA by two por-phyrins10 µL reaction mixtures contained 1.0 µg of plasmid DNA, time of illumina-tion was 12 min. (A) Concentration of two porphyrins was 2.0

32、81;mol/L. Lane 1: DNA alone; lane 2: DNA aloneh; lane 3: DNAPD; lane 4: DNAPDh; lane 5: DNAH2TMPyP; lane 6: DNAH2TMPyPh; (B) Concentra-tion of two porphyrins was 0.5 µmol/L. Lane 1: DNA alone; lane 2: DNA aloneh; lane 3: DNAPDh; lane 4: DNAH2TMPyPh.在较高浓度下(图7A), 两种卟啉化合物均能将共价闭环型(图中I型)DNA切割为切口开环型(

33、图中II型)DNA(见lane 4, 6); 而在较低浓度下(图7B), H2TMPyP仍能将其切割为切口开环型DNA (lane 4), 而PD则几乎没有切割现象发生(lane 3). 这个实验结果与前面卟啉与DNA的结合常数计算结果一致. 同样说明了双卟啉与DNA的结合力弱于参照物, 其结合常数和光诱导切割能力低于H2TMPyP. 导致这一结果的原因是双卟啉的分子构型和它与DNA的结合模式.3 结论以4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶为桥联试剂, 合成并表征了一种含有8个阳离子的水溶性双卟啉化合物. 使用紫外-可见光谱、荧光光谱、圆二色谱研究了水溶性双卟啉与CT DNA的相

34、互作用. 以EB荧光竞争法测定了其结合常数, 并研究了双卟啉对质粒DNA的光切割现象. 以广泛研究的H2TMPyP为对比, 双卟啉对DNA的键合及切割能力弱于这个参照物. 导致这个结果的原因是两种卟啉对DNA的不同结合模式以及双卟啉的分子构型, 桥联双卟啉的线性构型阻碍了其完全插入DNA.No. 22王 凯等：水溶性桥联双卟啉与DNA相互作用的研究260315 (a) Fiel, R. J.; Howard, J. C.; Mark, E. H.; Datta-Gupta, N.Nucleic Acids Res. 1979, 6, 3093.(b) Dougherty, G. J.; Pilbrow, R.; Skorobogaty, A.; Smith, T. D. J. Chem. Soc., Faraday Tran