绿粘帚霉_Gliocladiumvirens_厚垣孢子的生物学特性

1、Biological Characteristics of ChlamydosporeProduction by Gliocladium virensQIAO Tia n2min1,ZHU Tia n2hui1,LI Fa ng2lia n1,LIU Fu2ping1,ZHANG Yu2hong2(1.College of Forestry and Horticulture,Sichuan Agricultural University,Y aan625014,Sichuan,China;2.Forestry Bureau of Nanchuan City,Nanchuan408400,Cho

2、ngqing,ChinaAbstract:Factors influencing chlamydospore production of Gliocladi um vi rens and characteristic of the spore are studied.The optimal medium for chlamydospore production of G.vi rens is potato2dextrose liquid which is screened out from8kinds of mediums.In PD medium,the optimum culture co

3、nditions are p H3,30,rotating in the light.The acid environment greatly enhances chlamydospore forma2 tion and inhibited production of conidia entirely,and the numbers of chlamydospore production are 8100×106chlamydospores/mL in these conditions for a week;Studies of chlamydospore germinating s

4、how:The optimum germination p H value was p H68and the optimum temperature of germination is25;the germinating rate can reach above90%after48hours;the optimal temperature for storing is under5.K ey w ords:Gliocladi um vi rens;chlamydospore;biological control;biological characteristics绿粘帚霉(Gliocladi

5、um vi rens厚垣孢子的生物学特性谯天敏1,朱天辉1,李芳莲1,刘富平1,张毓红2(1.四川农业大学林学园艺学院,四川雅安625014;2.南川市林业局,重庆南川408400摘要:主要研究绿粘帚霉厚垣孢子的诱导因素及其生物学特性。营养条件和生态因子试验表明,PD为绿粘帚霉产厚垣孢子的最佳培养基,厚垣孢子产生的最适培养条件为:光照、振荡、p H3、30,在此条件下可完全抑制其分生孢子的产生,并在1周内可产生厚垣孢子8100×106个/mL;厚垣孢子萌发试验显示,25、p H为68为绿粘帚霉厚垣孢子的最佳萌发条件,48h时可达90%以上的萌发率,在5下贮存比较适宜。关键词:绿粘帚霉

6、,厚垣孢子,生物防治,生物学特性中图分类号:S763.1;S435.111.4文献标识码:A文章编号:1000-2650(200602-0166-05在一些真菌的菌丝中经常能见到不规则的肥大的菌丝细胞,一般是在不良环境条件下,菌丝细胞内的原生质收缩,变圆,外面形成一层厚壁,以抵抗不良环境,表面一般具有刺或瘤状突起,这种结构称为厚垣孢子。Caldwell于1958年首次观察到厚垣孢子在土壤中比分生孢子更容易存活。在无隔菌丝中,菌丝的一部分有时集中储藏养料,同时分泌厚壁,两端形成全封闭的隔膜而与菌丝其他细胞切断,形成厚垣孢子;而在有隔菌丝的较老菌丝部位往往形成厚垣孢子,它们一旦遇到适宜的环境条件它

7、们便萌发产生菌丝。绿粘帚霉(Gliocladi um vi rens是一种重要的生防颉抗菌,其厚垣孢子在存活等生物学方面的潜力已得到认同1。Lewis2和Beagle-Ristaino3分别用G.vi rens的菌丝体制备物和发酵生物量用于防治一些蔬菜的立枯病,得出了比分生孢子处理更好的防治效果。G.vi rens的菌丝体和厚垣孢子在土壤中的增殖比分生孢子更好,并且萌发率也更高3,这为应用拮抗体进行生物防治找到了新的途径。第24卷第2期2006年6月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.24No.2J un.2006收稿日期

8、:2006-03-01通讯作者(Corresponding author。厚垣孢子作为抵抗不良环境而休眠的生存结构,具有更容易大规模生产,容易贮藏、施用和商品化及货架寿命长等优点,能满足作为生物农药的要求,因此,绿粘帚霉大量厚垣孢子的诱导及其生物学特性的研究对该颉抗菌生物农药商品化生产具有重要的实践意义。1材料与方法1.1绿粘帚霉厚垣孢子的诱导1.1.1不同培养基对厚垣孢子产生的影响分别配制查氏(NaNO32g,K2HPO41g,KCl 015g,MgSO4015g,FeSO40101g,蔗糖30g,蒸馏水1000mL、G orodkowa(NaCl5g,牛肉膏10g,葡萄糖215g,蛋白胨1

9、0g,蒸馏水1000mL、PD(去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL、豆芽汁蔗糖(黄豆芽100g,蔗糖50g,蒸馏水1000mL、玉米粉(玉米粉6215g,蒸馏水1500mL、大米粒(大米粒100g,蒸馏水1000mL、红糖(红糖35g,酵母浸出汁3g,KNO32g,蒸馏水1000mL、牛肉膏蛋白胨培养(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸馏水1000mL8种液体培养基。1.1.2光照、振荡、培养时间对厚垣孢子产生的影响上述每种培养基,每瓶各装100mL(500mL三角瓶,121灭菌30min后备用。将活化2d的绿粘帚霉(四川农业大学林木病理室提供平板用孔径为015cm的

10、打孔器打孔,每瓶接种一菌块,每种培养基设4种处理:光照(14W,24h/d+振荡(120 r/mim;光照(14W,24h/d+静置;黑暗(用黑光纸包裹+振荡(120r/min;黑暗(用黑光纸包裹+静置;每种处理重复3次,在30下培养20d后,观察菌丝体形成情况和发酵液颜色的变化,收集厚垣孢子并计算发酵液厚垣孢子数/mL。对于产厚垣孢子最多的培养基在最佳条件下继续培养30d后,测定发酵液中厚垣孢子数/mL。厚垣孢子的制备参照文献4的方法,待菌丝丛产生大量的厚垣孢子后,用布氏漏斗滤取菌丝丛,放入盛有100mL无菌水的匀浆杯内,5000r/min匀浆3min,使菌丝体充分破碎。用血球计数器在显微镜

11、下计算出每1mL悬浮液中厚垣孢子的含量。然后将上述匀浆液1000r/min离心10min,弃上清液,用硅藻土吸附离心杯底的厚垣孢子,放入4冰箱中保存备用。1.1.3p H对厚垣孢子产生的影响将PD培养基调p H别为:2,3,4,5,6,7,8,9,10共8个处理,每种处理重复3次,灭菌后接种绿粘帚霉菌丝块各一块,在30、120r/min下,光照(14 W,24h/d振荡培养7d后,观察发酵液p H和颜色变化,收集厚垣孢子(同上,并测定发酵液中厚垣孢子数/mL。1.1.4温度对厚垣孢子产生的影响将PD培养基调p H为3,灭菌后接种绿粘帚霉菌丝块一块,在15、20、25、30、35共5个温度分别光

12、照(14W,24h/d振荡(120r/min培养7d后,收集厚垣孢子(同上,测定发酵液中厚垣孢子数/mL。1.2影响绿粘帚霉厚垣孢子萌发因素的研究1.2.1厚垣孢子贮存后的活力测定将制备的厚垣孢子粉剂分别置于4和25下贮存,经不同时间观测其萌发率,具体方法是将厚垣孢子用蒸馏水配制成孢子悬浮液(512×107个/ mL,在显微镜下镜检300个以上厚垣孢子,计算其萌发率。1.2.2环境因子对厚垣孢子萌发的影响将厚垣孢子用蒸馏水配成孢子悬浮液(5131×107个/mL,分别在不同温度条件下进行萌发试验,计算不同温度下的孢子萌发率;同时用盐酸和氢氧化钠调配成不同p H值的厚垣孢子悬

13、浮液(25,测定孢子萌发率。1.2.3厚垣孢子萌发所需时间将厚垣孢子配制成孢子悬浮液(5131×107个/ mL,置于25培养箱中,每隔4h检测一次其萌发状况,测定厚垣孢子萌发所需时间。2结果与分析2.1绿粘帚霉厚垣孢子的诱导条件的研究2.1.1培养基对厚垣孢子产生的影响绿粘帚霉在八种不同培养基中呈现了不同的菌丝形态,发酵液呈现出不同的颜色和澄清度,培养基对厚垣孢子产生的影响如表1所示,只有牛肉膏蛋白胨培养基和G orodkowa培养基没有产生分生孢子,但产生的厚垣孢子也不多,而且所设置的4种培养条件对分生孢子的产生没有影响。而在光照和振荡条件下,PD培养基产生了最多的厚垣孢子(11

14、50×106个/mL,豆芽汁培养基其次(1115×106个/ mL,但同时也产生了大量的分生孢子,其次为豆芽汁、大米粒、查氏培养基,其他组合条件下,PD培养基产厚垣孢子也处于前两位,综合上述因素,作者认为PD培养基为产厚垣孢子的最佳培养基。761第2期谯天敏(等:绿粘帚霉(Gliocladium virens厚垣孢子的生物学特性表1绿粘帚霉在不同培养基中不同培养条件下的厚垣孢子和分生孢子的产生量(×104个mL-1 Table1The numbers of chlamydospore and conidium produced by GV under differ

15、entcultural medium and conditions(×104chlamydosporesmL-1培养基种类Media光照+振荡Light+rotation黑暗+振荡Dark+rotation光照+静置Light+still黑暗+静置Dark+still牛肉膏蛋白胨培养基Beef extract peptide medium 2.73(-gA1.7(-fB0.7(-cdC0.7(-cdC查氏培养基Cazpek medium40(+dA 6.7(+dC12.5(+aB 2.3(+bD 玉米粉培养基Corn powder medium10(+eA5(+deB 1.5(+cC

16、1(+cCD 红糖培养基Sugar medium 2.5(+ghA5(+deB0(+cfC0(+deCPD培养基PD medium150(+aA27.5(+bB10(+bC5(+aD 豆芽汁培养基Bean juice medium115(+bA46.7(+aB0.3(+ceC0(+deCD 大米粒培养基Rice medium55(+cA17.5(+cB0(+cfC0(+deCG orodkowa培养基G orodkowa medium9(-efA 1.7(-fB0.7(-cdBC0(-deBD 注:“-”无分生孢子;“+”少量分生孢子;“+”较多分生孢子;“+”大量分生孢子;“3”厚垣孢子数量

17、。差异性检验(t<0105:小写字母为培养基间比较;大写字母为培养条件间比较,含不相同字母为差异性显著,否则,为不显著。Note:“-”no conidiospora;“+”a little conidiospora;“+”more conidiospora;“+”numerous conidios pora.“3”chlamydospore numberSignifcant test(t<0105:small letters show difference comparisons among columns;capital letters show difference comp

18、arison among rows,the same letter shows difference is not significant,otherwise,significant.2.1.2光照、振荡或静止条件对厚垣孢子产生的影响仅从外观上看,光照和黑暗对菌丝的生长繁殖影响不大。在振荡条件下,培养液的深层空气充分,绿粘帚霉的菌丝在深层发酵液中形成了许多不同形态的菌丝体,而在静置培养条件下,菌丝只在发酵液表面形成一层膜状菌丝体。表1显示在同一培养基条件下,光照和振荡更有利于厚垣孢子的产生,光照和振荡是诱导厚垣孢子的最佳条件,在此状态下, PD发酵液培养30d,每毫升含厚垣孢子可达2140&#

19、215;106个。黑暗振荡次之,黑暗静置对厚垣孢子的产生无实际意义。作者认为,在振荡条件下,可以看到许多菌丝形成了球状或饼状的菌丝体,使菌丝体内部形成了厌氧环境,对于耗氧菌绿粘帚霉来说,正是这种恶劣的厌氧环境诱导它产生了厚垣孢子,这与文献4中诱导厚垣孢子产生所创造的厌氧环境相一致。2.1.3p H对厚垣孢子产生的影响p H对厚垣孢子产生的影响如表2所示。PD培养液的p H只有在2和3时,绿粘帚霉不产生分生孢子;当p H为10时,有大量的分生孢子产生(瓶壁绿色分生孢子,而厚垣孢子的量却达到了最小值(1157×105个/mL;当p H为3时,绿粘帚霉产生了最大量的厚垣孢子(8100

20、15;106个/mL。培养液的p H为3时,大大地刺激了厚垣孢子的产生,同时抑制了分生孢子的产生,而当p H为9和10时,却刺激了分生孢子的产生,也抑制了厚垣孢子的产生。表2不同pH对绿粘帚霉厚垣孢子和分生孢子产生的影响Table2The effect of various p H on chlamydospore andconidium producted by GVp H发酵液p H变化p H change ofculture liquid厚垣孢子数(×104个mL-1Chlamydospore number 2253.33(-h3 3.8800(-a46400(+b5 6.56

21、3.3(+g6 6.286.5(+de7 6.590(+d8 6.5243(+c9746(+i107.515.7(+j自然 6.883(+ef注:“-”无分生孢子;“+”少量分生孢子;“+”较多分生孢子;“+”大量分生孢子;“3”厚垣孢子数量。含不相同字母为差异性显著,否则,为不显著(t<0105。Note:“-”no conidiospora;“+”a little conidiospora;“+ +”more conidiospora;“+”numerous conidios pora;“3”chlamydospore number.the same letter shows dif

22、ference is not significant,otherwise,significant.2.1.4温度对厚垣孢子产生的影响不同温度对绿粘帚霉厚垣孢子产生的影响见图1,温度较高有利于厚垣孢子的产生,30是绿粘帚霉产生厚垣孢子的最佳温度。很明显,厚垣孢子的861四川农业大学学报第24卷产生是绿粘帚霉在高温环境下的一种重要的生存方式,这与Trione 5和Englander 6的观点相一致 。图1温度对厚垣孢子产生的影响Fig1The effect of the temperature on chlamydospore producted by GV2.2不同环境条件对厚垣孢子萌发的影响贮

23、存温度、时间对厚垣孢子的活力影响如图2所示,绿粘帚霉厚垣孢子在不同温度下随着贮存时间的延长,萌发率逐渐下降,在5下贮存8个月后,萌发率降到70%,而在25下贮存同样时间后,萌发率下降得比较快,已降到25%,说明在5下贮存较为适宜 。图2不同温度下厚垣孢子贮存后的萌发率Fig 2The germinating rate of chlamydosporestored under different temperature不同温度对绿粘帚霉厚垣孢子萌发的影响如图3所示,绿粘帚霉厚垣孢子萌发的最适温度为25,25时萌发率为92%,而温度在15以下和35以上几乎不萌发。图4显示了不同p H 值下绿粘帚霉

24、厚垣孢子萌发的影响。厚垣孢子萌发的最适p H 是68,该p H 范围下的萌发率为83%90%。绿粘帚霉厚垣孢子萌发率与时间的关系如图5,厚垣孢子在20h 内只有30%的萌发率,48h 后,萌发率可达到92%以上 。图3不同温度对厚垣孢子萌发的影响Fig 3The germinating rate of chlamydosporeunder different temperature图4p H 值对厚垣孢子萌发的影响Fig 4The germinating rate of chlamydospore under different p H图5厚垣孢子萌发率与时间的关系Fig 5The relat

25、ionship between germinatingrate of chlamydospore and time3讨论与结论Tsao 4先在25mL 液体培养基中接种培养,24h 后用手摇晃使从接种块上长出的菌丝破裂成菌丝片断,静止培养一周,然后在培养液中加入100mL 灭菌水,使Phytophthora parasitica 菌丝丛沉没在液体深层,23周后可以获得大量的厚垣孢子,而分961第2期谯天敏(等:绿粘帚霉(Gliocladium virens 厚垣孢子的生物学特性生孢子在液体深层被抑制。作者按此方法诱导绿粘帚霉菌的厚垣孢子,却未能达到目的,但将PD培养基调p H为3时,在光照和振

26、荡的条件下形成了大量的菌丝球后,停止振荡,这时菌丝球都沉没在液体深层,静止培养一周后作者获取了大量厚垣孢子,并且完全抑制了分生孢子的产生。Cochrane7曾报道酸化的并含有葡萄糖和无机盐的培养基可在短时间内诱导大量的厚垣孢子,那么p H为3的PD培养液恰如其分地验证了此说法。在作者所选取的8种培养基中,产厚垣孢子最多的是PD培养基,其次为豆芽汁培养基,这与Englander6用V8肉汤和Sush2 ma8用洋葱头汁液诱导厚垣孢子的方法有些相似,蔬菜汁在诱导厚垣孢子方面显示了一定作用。另外,随着培养时间的延长,营养物质的耗尽,有利于厚垣孢子的产生,很明显厚垣孢子是GV渡过恶劣环境的一种生存方式

27、。厚垣孢子由于具有容易大规模生产,容易贮藏、施用和商品化及货架寿命长等优点,我们摸索了绿粘帚霉菌形成厚垣孢子的生态条件,但厚垣孢子只有在萌发成菌丝后才可发挥它的生防作用,Lums2 den9认为绿粘帚霉菌的厚垣孢子萌发后能产生生长代谢必需的酶,并通过产生胶霉毒素影响了丝核菌和腐霉菌的萌发和生长。因此我们又进一步研究了该菌的厚垣孢子萌发的最适条件,这为绿粘帚霉厚垣孢子的实用化提供理论基础,但离体情况下获得的萌发条件尚需在田间进行验证。参考文献:1Papavizas G C.Biological control of soil2borne fungal propagulesJ.A nn Rew Phytopath,1980,18:369-413.2Lewis J A.Effect of myceial preparations of T richoderma andGliocladi um on populations of Rhizoctonia solani and the inci2 dence of damping2offJ.Phytopathol,1985,75:812-817.3Beagle-Ristaino J E.Survival and proliferation of propagules ofT rich