超声联合微泡增效骨髓间充质干细胞归巢治疗缺血性脑卒中

1、钱健，范国峰，徐鹏，李启明，沙杜鹃，王军，张均(南京大学医学院附属鼓楼医院急诊科，江苏省南京市 210008)引用本文：钱健，范国峰，徐鹏，李启明，沙杜鹃，王军，张均. 超声联合微泡增效骨髓间充质干细胞归巢治疗缺血性脑卒中J.中国组织工程研究，2017，21(25):4007-4012.DOI:7.25.012ORCID: 0000-0002-2635-6019(范国峰)文章快速阅读：超声联合微泡增效骨髓间充质干细胞归巢治疗缺血性脑卒中研究流程图造模：建立雄性SD大鼠大脑中动脉栓塞模型术后3 d分组干预超声+骨髓间充质干细胞组(n=18)：经颅骨超声(频率1 MHz，功率 2 W/cm2) 辐

2、照120 s，静脉注射3×106骨髓间充质干细胞超声+微泡+骨髓间充质干细胞组(n=18)：超声辐照前静注微泡对比剂 0.1 mL/kg，静脉注射3×106骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞组(n=18)：静脉注射3×106骨髓间充质干细胞PBS组(n=15)：静脉注射2 mL PBS钱健，男，1983 年生，江苏省南京市人，汉族，2015年南京医科大学毕业，主治医师，主要从事缺血性脑卒中与神经细胞修复研究。通讯作者：范国峰，硕士，主治医师，南京大学医学院附属鼓楼医院急诊科，江苏省南京市 210008中图分类号:R3文献标识码:B文章编号:2095-4344(201

3、7)25-04007-06稿件接受：2017-03-10Qian Jian, Attending physician, Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, ChinaCorresponding author: Fan Guo-feng, Master, Attending physician, Department of Emergency, Nanjing Drum Tower H

4、ospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China结论：(1)超声联合微泡可促进骨髓间充质干细胞的脑内靶向归巢；(2)能够减少脑水肿和脑梗死体积，改善神经功能评分；(3)增效骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的效果。造模后1，7，14，21，28 d：(1)荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞归巢；(2)改良神经功能缺损评分评价大鼠神经损害严重程度；(3)干湿重法测定脑组织含水率；(4)TTC染色法计算脑梗死体积。文题释义：超声微泡：是一种超声对比剂，结构包括核心及外壳2个部分，

5、核心由二氧化碳、氧气、空气或大分子惰性气体等构成，外壳可由磷脂类化合物、白蛋白、糖类、非离子表面活性剂或可生物降解的高分子多聚物等不同材料组成。在疾病诊断上，它用于提高超声图像质量；在治疗上，它作为一种载体，与超声波相互作用产生生物学效应，实现所携带药物及基因等向靶向组织的传递释放，或利用声学空化效应增效干细胞或药物靶向进入组织。干细胞归巢：是指自体或外源性干细胞在多种因素如免疫炎症反应过程中的多种趋化因子、生长因子及黏附分子的作用下，定向趋向性迁移穿过血管内皮细胞至靶向组织并定植存活的过程。摘要背景：国内外动物实验结果表明，超声微泡能够促进移植干细胞归巢到缺血区，增强血管新生和小动脉生成，改

6、善缺血心肌局部血流量，恢复心肌收缩功能。目的：探讨超声联合微泡对静脉移植骨髓间充质干细胞归巢的影响及治疗缺血性脑卒中的有效性。方法：插线法建立大脑中动脉栓塞大鼠模型，建模72h后，随机分为4组：PBS组(n=15)，骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组(n=18)。PBS组经尾静脉注射2mL PBS；骨髓间充质干细胞组将骨髓间充质干细胞(约3×106)用2mL PBS稀释后经尾静脉缓慢注射；超声+骨髓间充质干细胞组经颅骨超声(频率1MHz，功率2W/cm2)辐照120s，给予骨髓间充质干细胞；超声+微泡+骨髓间充质干细胞

7、组在超声辐照前静注微泡对比mL/kg，再给予骨髓间充质干细胞。结果与结论：移植后48h，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组细胞的脑内归巢率高于骨髓间充质干细胞组和超声+骨髓间充质干细胞组，差异均有显著性意义(P<0.05)；造模后28d，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组的神经损害程度较其余组轻，差异均有显著性意义(P<0.05)；移植后7d，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组的脑组织含水率较其余组低，差异均有显著性意义(P<0.05)；移植后7d，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组脑梗死体积较其余组小，差异有显著性意义(P<0.05)；结果表明，超声联合微泡可促进骨髓间充质干细胞的脑

8、内靶向归巢，能够减少脑水肿和脑梗死体积，改善神经功能评分，增效骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的效果。关键词：干细胞；移植；超声微泡；骨髓间充质干细胞；缺血性脑卒中；归巢主题词：脑缺血；骨髓；间质干细胞移植；微气泡；超声处理；组织工程基金资助：南京市医学科技发展项目基金(YKK16100)；江苏省卫生厅青年科研课题(Q201306)Ultrasound-mediated microbubble promotes bone marrow mesenchymal stem cell homing in the treatment of ischemic strokeQian Jian, Fan

9、 Guo-feng, Xu Peng, Li Qi-ming, Sha Du-juan, Wang Jun, Zhang Jun (Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China)AbstractBACKGROUND: In animal experiments, ultrasound-mediated microbubbles can promote the homing of t

10、ransplanted stem cells to the ischemic area, enhance angiogenesis and small arterial formation, improve local blood flow in the ischemic myocardium and restore myocardial contractility.OBJECTIVE: To investigate the effect of ultrasound-mediated microbubbles on intravenously transplanted bone marrow

11、mesenchymal stem cell (BMSC) homing and the therapeutic efficiency on ischemic stroke. METHODS: A middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was induced by plug wire preparation. At 72 hours after MCAO, model rats were randomized into four groups: PBS group (n=15), BMSCs group (n=18), ultrasound+

12、BMSCs group (n=18), ultrasound+microbubble+BMSCs group (n=18). Corresponding treatment was done in each group: 2 mL of PBS was injected via tail vein in the PBS group; about 3×106 BMSCs diluted by 2 mL of PBS were injected via tail vein slowly in the BMSCs group; after skull ultrasound radiatio

13、n (1 MHz, 2 W/cm2) for 120 seconds, BMSCs were injected via tail vein slowly in the ultrasound+BMSCs group; the same process as the ultrasound+BMSCs group was done following intravenous injection of 0.1 mL/kg microbubbles in the ultrasound+microbubble+BMSCs group. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Forty-e

14、ight hours after BMSCs transplantation, the BMSCs homing rate in the brain was significantly higher in the ultrasound+microbubble+BMSCs group than the other two groups (P < 0.05). (2) Twenty-eight days after MCAO, nerve damage was significantly milder in the ultrasound+microbubble+BMSCs group tha

15、n the other two groups (P < 0.05). (3) Seven days after transplantation, the water content in the brain tissue was significantly lower in the ultrasound+microbubble+BMSCs group than the other two groups (P < 0.05). (4) Seven days after transplantation, the cerebral infarction volume was signif

16、icantly reduced in the ultrasound+microbubble+BMSCs group compared with the other two groups (P < 0.05). To conclude, ultrasound-mediated microbubbles can enhance the homing effect of intravenously transplanted BMSCs, reduce cerebral edema and cerebral infarction volume, improve the neurological

17、function, and increase the therapeutic effect of BMSCs transplantation on ischemic stroke. Subject headings: Brain Ischemia; Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Microbubbles; Sonication; Tissue EngineeringFunding: the Medical Development Foundation of NanjingCity, No. YKK16100; the Y

18、outh Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health Department, No. Q201306Cite this article: Qian J, Fan GF, Xu P, Li QM, Sha DJ, Wang J, Zhang J.Ultrasound-mediated microbubble promotes bone marrow mesenchymal stem cell homing in the treatment of ischemic stroke. Zhongguo Zuzhi Gongcheng

19、 Yanjiu. 2017;21(25):4007-4012.0引言 Introduction脑卒中是60岁以上老年人的第二大死因1。缺血性脑卒中是最常见的卒中类型，占全部脑卒中的87%。部分患者预后良好，但有超过50%的患者遗留功能障碍2。骨髓间充质干细胞是具有自我更新和多向分化能力的亚全能干细胞，具有归巢至缺血脑组织的能力。多个基础实验证实移植的骨髓间充质干细胞对缺血性脑卒中有神经保护作用3-5，但因为存在血脑屏障，移植细胞迁移至梗死区能够存活并分化的数量很少，动物实验提示只有移植细胞数的1.6%-3.2%6-7，提高移植细胞向缺血区的靶向归巢能力以增加移植效率是亟待解决的根本问题。课题组

20、实验研究发现，超声微泡能够增强干细胞移植治疗心肌梗死的效果，改善梗死后心功能8，且对移植细胞的增殖、凋亡及细胞周期无不良影响9。为此，实验拟探讨超声微泡对静脉注射的骨髓间充质干细胞向缺血脑组织归巢的影响，以及治疗缺血性脑卒中的有效性，寻找一种更有效的增效骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑卒中的方法。1 材料和方法 Materials and methods设计随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2014年6至10月在南京鼓楼医院科研部实验室完成。1.3 材料 实验动物 经慢病毒GFP质粒转染的雄性SD大鼠2只，5周龄，体质量100-150g；SPF级雄性SD大鼠69只，2.5个月龄，体质量2

21、40-270g，由南京鼓楼医院实验动物中心提供。 主要试剂及仪器 胎牛血清(美国Hyclone公司)；0.25%胰酶(美国Gibco公司)；L-DMEM 培养液(美国Hyclone公司)；淋巴细胞分离液Ficoll-Paque(天津灏洋生物公司)；抗大鼠FITC-CD44(美国MyBioSource公司)；抗大鼠FITC-CD34(美国Beckman Coulter公司)；抗大鼠FITC-CD29、FITC-CD45(美国BioLegend公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；TTC试剂盒(南京建成生物工程研究所)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；倒置相差显微镜

22、(重庆光学仪器厂)；荧光正立显微镜(日本Nikon公司)；超声波治疗仪(北京中西远大化玻仪器有限公司)；微泡对比剂(六氟化硫微泡)(瑞士Bracco Suisse SA)。1.4 实验方法 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定 大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养：取GFP质粒转染的2只SD大鼠断颈处死，以体积分数75%乙醇浸泡全身消毒10min，超净台上分离取出胫骨和股骨，剪去骨骺端，露出骨髓腔，PBS冲出骨髓，将骨髓悬液加入到相同体积、密度为kg/L的淋巴细胞分离液上层，400×g离心20 min，收集界面层，用含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM重悬，于设定温度37、体积分数为

23、5%CO2培养箱内培养。48h后换液，弃未贴壁细胞，以后1周换液2次，待细胞达80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后按12传代，进行体外扩增。大鼠骨髓间充质干细胞流式细胞学鉴定：取培养至第3代生长良好的骨髓间充质干细胞，经0.25%胰酶消化、离心收集细胞，调整细胞浓度为1×1010 L-1。经形态学观察及流式细胞仪检测表面分子标记CD34、CD45、CD29、CD44表达进行鉴定。 大鼠大脑中动脉栓塞模型制备 线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型，具体方法详见参考文献10-11。大脑中动脉栓塞后2h，再灌注前采用Longa 5等级法对大鼠神经功能进行评分12。得分为2分或3分为

24、造模成功。缺血2h再次麻醉造模成功的大鼠，抽出栓塞线段至颈外动脉处，遇到阻力即停止。扎紧丝线，剪断血管外多余的丝线，实现再灌注。术中及术毕2h内用60W的白炽灯垂直距离50cm照射大鼠，使其肛温保持(37.0±0.5)。 实验分组与干预 69只造模成功大鼠，随机分为对照组(PBS组，n=15)，骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组(n=18)。于造模后72 h建立大鼠尾静脉通路，进行如下干预：PBS组直接经尾静脉注射2 mL PBS，骨髓间充质干细胞组将骨髓间充质干细胞(约3×106)用2 mL PBS稀释后经

25、尾静脉缓慢注射13；超声+骨髓间充质干细胞组大鼠颅顶脱毛，超声耦合剂将超声探头与颅骨紧密结合，超声(1 MHz，2 W/cm2，作用时间120 s)作用后，将骨髓间充质干细胞(约3×106mL/kg，同样超声干预后将骨髓间充质干细胞(约3×106)用2 mL PBS稀释后经尾静脉缓慢注射。荧光显微镜观察各组GFP标记骨髓间充质干细胞的归巢 骨髓间充质干细胞移植48 h后，处死除PBS组以外的其他3组大鼠(n=3)，取出全脑组织后冷冻，于冠状面漏斗柄层面制成厚度约7 m的冰冻切片，荧光显微镜下观察右侧基底节脑卒中区域及其周围区域的GFP绿色荧光标记情况。每只大鼠取3张切片，每

26、张切片200倍荧光显微镜下拍摄3张照片，采用Image Pro Plus 6.0数码图像分析系统软件处理后计算各组缺血区绿色荧光积分吸光度，统计分析各组骨髓间充质干细胞移植后的归巢情况。 评价大鼠神经损害严重程度 每组取6只大鼠，分别于造模后1，7，14，21，28d进行改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Scores，mNSS)6，观察各组大鼠神经功能损害程度的动态变化。 干湿重法测定脑组织含水率 移植后1，3，7d各组取3只大鼠，处死后迅速断头，完整取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，置于培养皿中，滤纸吸干表面水分，电子天平精确称量湿重，然后置于

27、95烘箱内烘干24h至恒重，电子天平精确称量干重。干湿重法计算脑组织含水率。脑组织含水率=(湿重-干重)/湿重×100% 14。 TTC染色法计算脑梗死体积占全脑体积比 以2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)对各组脑组织染色15，根据染色结果测定脑梗死体积。于移植后7d各组取3只大鼠，处死后迅速断头，完整取脑，-70快速冷冻。自前向后将大鼠脑连续切成5片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，第二刀在视交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。放入1%的TTC磷酸缓冲液中，37避光染色30min，PBS冲

28、洗后置于40g/L多聚甲醛溶液中固定保存。正常脑组织染为红色，梗死组织为白色。爱普生扫描仪1200dpi分辨率扫描标本。图像经过Image Pro Plus 6.0数码图像分析系统软件处理，计算梗死体积占全脑体积比。1.5 主要观察指标骨髓间充质干细胞的归巢率；神经损害严重程度；脑组织含水率；梗死体积占全脑体积比。1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析，计量资料数据以均值±标准误(Mean±SEM)表示。服从正态分布的计量资料2组比较采用成组t检验；3组及以上比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)；组间两两比较采用Student Ne

29、wman Keuls(SNK)检验，P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析共实施造模SD大鼠76只。术中因完全切断颈总动脉失败2例，术后72h以内因严重神经功能缺损死亡3只，继发颅内出血死亡2只，术后72h共有69只大鼠存活，存活率为90.8%。存活72h以上的大鼠进入分组实验，中途无脱落。2.2 超声微泡干预增加骨髓间充质干细胞的归巢率 荧光显微镜观察各组大鼠脑缺血区域冰冻切片显示(图1)，缺血区脑组织内出现散在绿色荧光颗粒为GFP标记的骨髓间充质干细胞。超声+微泡+骨髓间充质干细胞组积分吸光度(224363.87±19723.9

30、7)明显高于骨髓间充质干细胞组(199016.21±16918.42)、超声+骨髓间充质干细胞组(205330.94±13957.45)，差异有显著性意义(P < 0.05)，骨髓间充质干细胞组和超声+骨髓间充质干细胞组比较差异无显著性意义。提示超声+微泡+骨髓间充质干细胞组归巢细胞明显增多。2.3 超声微泡干预减轻大脑中动脉栓塞模型大鼠神经损害严重程度 在造模后14 d，各组mNSS分值开始出现差异。骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组在造模后14，21，28 d的神经损害程度均轻于PBS组，但仅28 d差异有显著性意义(P<0.01)；超声+微泡+骨

31、髓间充质干细胞组造模后14，21，28d的神经损害程度均轻于PBS组，差异均有显著性意义(P<0.01)；超声+微泡+骨髓间充质干细胞组造模后28d的神经损害程度较骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组更轻，差异均有显著性意义(P<0.05)；骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组比较差异均无显著性意义，见表1。2.4 超声微泡干预降低大脑中动脉栓塞模型大鼠脑组织含水率 各组大鼠脑组织含水率在造模后升高。在造模后6d即干细胞移植后3d为著，并可见移植后7d含水率降低。在移植后1，3d，各组含水率差异无显著性意义(P>0.05)；在移植后7d，各组含水率均较PBS组

32、低，与骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组比较，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组含水率显著降低，其差异有显著性意义(P<0.05)；骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组比较差异均无显著性意义，见表2。2.5 超声微泡干预缩小大脑中动脉栓塞模型大鼠脑梗死体积细胞移植后7d(造模后10d)梗死累及范围主要为额顶叶的背外侧皮质、尾壳核、下丘脑部分，严重时累及到海马区(图2)。测量后发现超声+微泡+骨髓间充质干细胞组脑梗死体积为(15.40±0.88)%，与骨髓间充质干细胞组(17.00±0.63)%，超声+骨髓间充质干细胞组(17.31±0.95)%

33、，PBS组(19.51±1.10)%比较，梗死体积明显缩小，差异有显著性意义(均P<0.05)，见表3。D CB A图1 荧光显微镜下各组骨髓间充质干细胞归巢情况(×200)Figure 1 Homing of bone marrow mesenchymal stem cells in each group under fluorescence microscope (×200)图注：图中A为PBS组脑组织缺血区域冰冻切片自然光摄片；B为骨髓间充质干细胞组脑组织缺血区域荧光表达；C为超声+骨髓间充质干细胞组脑组织缺血区域荧光表达；D为超声+微泡+骨髓间充质干

34、细胞组脑组织缺血区域荧光表达。图2 移植后7 d大鼠脑组织TTC染色(冠状位海马平面)Figure 2 Brain tissue TTC staining at 7 days after transplantation图注：图中A为正常对照；B为PBS组；C为骨髓间充质干细胞组；D为超声+骨髓间充质干细胞组；E为超声+微泡+骨髓间充质干细胞组。由图可见，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组梗死体积明显缩小。 E D C B A表1 各时间点大鼠mNSS评分 (±s，n=6)Table 1 Modified neurological severity scores of rats at di

35、fferent time points组别1 d7 d14 d21 d28 dPBS组骨髓间充质干细胞组超声+骨髓间充质干细胞组超声+微泡+骨髓间充质干细胞组FP< < 表2 各时间点脑组织含水率比较 (±s，n=3，%)Table 2 Water content of the brain tissue at different time points 表注：与同时间点其他组比较，aP < 0.01；与同时间点骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组比较，bP < 0.05。组别1 d3 d7 dPBS组79.94±a骨髓间充质干细胞组超声+骨髓

36、间充质干细胞组超声+微泡+骨髓间充质干细胞组bFP表3 移植后7 d各组脑梗死体积占全脑体积百分比 (±s，n=3，%)Table 3 Cerebral infarction percentage at 7 days after cell transplantation组别梗死体积占全脑体积百分比S-N-K检验*PBS组A骨髓间充质干细胞组B超声+骨髓间充质干细胞组B超声+微泡+骨髓间充质干细胞组C表注：* S-N-K检验两两比较时，两组字母不同表示组间有差异。3 讨论 Discussion采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉栓塞模型，模拟体内缺血。日本学者Koizumi等16于1986

37、年首次采用不开颅经颈内动脉栓入尼龙线致大脑中动脉栓塞获得成功，后经Longa的适当改进12，该动物模型被公认为实验性局灶性脑缺血标准模型。该模型不会像诸如颈内动脉注射栓塞剂栓塞一类的方法，会造成永久脑栓塞，优点是可形成脑缺血损伤后再灌注，更符合人类脑梗死或溶栓药物治疗后血管再通的机制。骨髓间充质干细胞是骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的一系列基质干细胞的混合群体，在体内其主要作用是构成骨髓造血干细胞的微环境。实验研究表明，大脑中动脉缺血损伤后24h尾静脉注射骨髓间充质干细胞，大鼠行为功能恢复明显增强7；即使1个月后静脉注射骨髓间充质干细胞治疗，仍可观察到相似的治疗益处17，并可持续1年以上18

38、；而且，骨髓间充质干细胞早期干预治疗的神经保护作用更强19。因此，将自身骨髓间充质干细胞进行体外培养和扩增，然后移植到患者体内，是治疗缺血性脑卒中的潜在可行的理想手段。然而，脑梗死患者骨髓干细胞数量减少、功能低下，同时存在血脑屏障，移植细胞迁移至梗死区能够存活并分化的数量仍很少，动物实验提示只有移植细胞数的1.6%-3.2%2-3。因此，如何将更多骨髓间充质干细胞移植到需要的区域，即归巢至缺血梗死区，提高其移植治疗的效率是尚未解决的重要科学问题。目前研究解决方案集中在以下几方面：选择合适的移植途径20-21：脑实质内或梗死液化腔内立体定向注射、外周静脉注射、经颈内动脉注射、脑池或脑室内移植是已

39、知的几种移植方法。其中经外周静脉和颈内动脉注射干细胞的研究相对较多，但其移植效率仍然很低；将单次干细胞移植改成反复多次移植；应用一些细胞因子和趋化因子提高骨髓间充质干细胞归巢能力：如用基因转染方法对骨髓间充质干细胞进行基因修饰表达血管内皮生长因子、CXCR4等。然而，后2种方法的实施存在成本高、创伤大、安全性低等缺点，并仍在动物实验探索阶段。近期国内外动物实验结果表明，超声微泡能够促进移植干细胞归巢到缺血区，增强血管新生和小动脉生成，改善缺血骨骼肌和心肌局部血流量，恢复心肌收缩功能和骨骼肌运动功能8，22-23。此外，已有实验证实，超声波作用下血脑屏障通透性一过性增加24，有利于化疗药物、治疗

40、性抗体进入脑内发挥治疗作用。实验结果表明，经静脉注射移植骨髓间充质干细胞能够改善脑梗死后28d神经功能损害程度，而超声联合微泡作用后移植骨髓间充质干细胞，能够在干预后14d进一步改善神经损害程度，且超声微泡干预可降低脑组织含水率和脑梗死体积。因此，超声联合微泡作用下移植骨髓间充质干细胞，能够更有效的减轻脑梗死后脑水肿和梗死体积，促进梗死后大鼠神经功能恢复，可能与其能够增加骨髓间充质干细胞脑内归巢数量有关。超声微泡促进移植干细胞脑内归巢增多的机制目前仍不明确，有研究表明：超声微泡能够使血管内皮细胞间隙增宽，血脑屏障通透性增高25，并可能引起某些细胞因子或趋化因子表达增加，如神经营养因子、血管内皮

41、生长因子4、内源性促红细胞生成素26、突触素、基质细胞衍生因子1、一氧化氮27-28，这些因素均有利于骨髓间充质干细胞向脑内缺血梗死区归巢，促进局部血管生成以及形成新的神经突触细胞。 综上所述，骨髓间充质干细胞经静脉移植有助于大鼠缺血性脑组织的修复，减少梗死脑组织含水率，缩小脑梗死体积，改善神经功能；而超声微泡可增加移植干细胞在大鼠缺血再灌注损伤脑组织内的归巢率，提高干细胞治疗缺血性脑卒中的效果。作者贡献：实验设计为钱健、范国峰，实验实施为钱健、范国峰、李启明，实验评估为沙杜鹃、王军、张均，资料收集为范国峰。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经南京鼓楼医院动物实验

42、伦理委员会批准，批准号为20140503。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会关于动物伦理与福利的作者指南共识和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章撰写与编辑修改后遵守了动物实验体内实验研究报告规范指南(ARRIVE指南)。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：通讯作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全

43、体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4参考文献 References1 Lozano R, Naghavi M, Foreman K, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death

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