成骨诱导后骨髓间充质干细胞与A-WMGC支架材料联合培养的实验研究

1、成骨诱导后骨髓间充质干细胞与A-WMGC支架材料联合培养的实验研究                      作者：王岩松,刘丹平,周大利，梅晰凡 【摘要】  目的 研究多孔磁性硅灰石/磷灰石玻璃陶瓷载体A-WMGC支架（apatite-wollastonite magnetic glass ceramic,A-WMGC）作为组织工程骨支架的可行性。方法 体外培养兔骨髓间充质干

2、细胞，在成骨诱导剂地塞米松等的诱导下，向成骨细胞转化，并使之与修饰后A-WMGC支架复合，通过倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察细胞贴附情况。结果 地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化，碱性磷酸酶表达明显增高，并表达型胶原。A-WMGC支架具有合适的微孔结构，材料大孔孔径为300400 m,且孔道相互贯通，体外复合培养10小时，成骨细胞即开始贴附于支架上，复合培养7天，成骨细胞在支架上分化增殖，分泌细胞外基质。结论 适当浓度成骨诱导剂可成功的将兔BMSCS成骨细胞诱导，修饰后A-WMGC支架是骨组织工程的良好载体。 【关键词】  骨髓间充干质细胞 成骨诱导 A-WMGC载体 生物

3、相容性 Abstract: Objective  To investigate the feasibility of apatite-wollastonite magnetic glass ceramic (A-WMGC) as scaffold material in bone tissue engineering.Methods  The purified bone marrow stromal cells which were separated from rabbit were induced into osteoblasts by Dexamethasone, -

4、glycerophophate and Vitamin C and co-cultured with modified A-WMGC in vitro. The cell-meterial complex was observed under phase microscope and electronic scanning microscope in order to evaluate the interaction between cells and A-WMGC. Results  The form of the induced cells by Dexamethasone wa

5、s converted to like-osteoblasts, the expression of ALP increased obviously，and the expression of Collagen I was observed . A-WMGC Possessed good macro porous structure: the size of macro pores was 300400 m in diameter, and pores interconnected each other. Ten hours after co-culture, the osteoblasts

6、adhered to A-WMGC scaffolds. Seven days later, the osteoblasts differentiated and proliferated in A-WMGC network. Extracellular matrix was secreted among osteoblasts. Conclusions   Rabbit bone marrow stromal cells can be induced into marrow stromal osteoblasts by suitable contents of dexam

7、ethasone. Modified A-WMGC is a good scaffold material for the bone tissue engineering.        Key words: bone marrow stromal cells;osteoblasts induction;apatite-wollastonite magnetic glass ceramic; biocompatibility 骨缺损修复一直是骨科临床的棘手问题，目前常用的修复方法均存在一定的缺点，难以满足临床需要。组织工程骨

8、再造被认为是最有前景的骨缺损治疗修复方法。在一定诱导条件下，可使BMSCs向成骨细胞分化的数目大大增加1,2，表明其具有很强的成骨潜能，是应用最为广泛的种子细胞。细胞与支架材料的相互作用是组织工程研究的主要领域,细胞与材料的粘附是基础,细胞必须与材料发生适当的粘附才能进行迁移、分化和增殖。    单一的材料难以满足骨组织工程细胞外支架材料的要求，只有通过合适的方法将几种材料组合，在性能上互相取长补短，形成复合支架材料3。AW（apatite-wollastonite）生物活性玻璃陶瓷作为一种硬组织修复材料，具有理想的生物活性和骨重建功能4,5。AW生物活性玻璃陶瓷

9、植入体内后，表面溶解，释放出硅离子，能为羟基碳酸磷灰石形成提供合适成核位置，体液中的和溶解产生的钙离子、磷离子则沉积生成富钙、磷无定形层，并最终转化为能与组织紧密结合的结晶羟基碳酸磷灰石层，其化学组成和结构均与骨组织中的矿化相接近。    本实验体外培养兔BMSCS，在成骨诱导剂的诱导下，向成骨细胞转化，并将其作为种子细胞，A-WMGC为支架材料，观察细胞在材料上的生长情况，探索A-WMGC作为组织工程骨支架的可行性。    1  实验材料和方法 1.1   实验材料与试剂 1.1.1  实验材

10、料  96 孔培养板和24 孔培养板,胎牛血清,胰蛋白酶，TritonX-100,地塞米松，维生素C, -甘油磷酸钠，碱性磷酸酶试剂盒，多聚赖氨酸， A-WMGC载体（由四川大学周大利教授惠赠），I型胶原原位杂交试剂盒。 1.1.2  实验动物  1.5 月龄健康新西兰大耳白兔1 只(由锦州医学院实验动物中心提供，动物质量许可证号：SYXK（辽）2003-0011)，体重2 kg。 1.1.3  实验仪器  倒置相差显微镜 , AT-858自动酶标分析仪，CO2 培 养 箱，超净工作台，扫描电子显微镜。 1.2  实验方法 1.2.1

11、  兔BMSCs的分离和培养：选1.5 月龄新西兰白兔，无菌状态下于兔股骨近端抽取骨髓2 mL，采用贴壁筛选法，接种于培养瓶中， 72 小时后更换培养液，每日在倒置相差显微镜下观察，3 天换液1 次。原代培养的BMSCS接近90%时，以0.25%胰蛋白酶消化，离心，弃上清，制成细胞悬液，细胞计数，按1×105 / 瓶接种，每日在倒置相差显微镜下观察。    1.2.2  兔BMSCs的成骨诱导及鉴定：细胞传至第3代后，进行成骨诱导 ,实验分诱导组和非诱导组，诱导液为10-8mol/L地塞米松,10 mmol/L -甘油磷酸钠

12、和50 mg/L维生素C, 倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，分别在适当的时间测定碱性磷酸酶含量、型胶原的表达情况、Vonkossa染色。    碱性磷酸酶含量测量 0.25胰蛋白酶消化细胞后，细胞计数，以2 000 个/孔的密度接种于5 块96 孔培养板上。实验分2 组：诱导组和非诱导组；每组10 孔，每3 天换液，于第4、6、8、10、12天分别取出1 块培养板，经0.5% TritonX-100处理后，4 冰箱过夜，用酶标分析仪测碱性磷酸酶含量。     型胶原的表达检测 0.25胰蛋白酶消化细胞后，细胞计数，以1×1

13、04个/孔的密度接种于24 孔培养板。培养板内置预先经多聚赖氨酸防脱片处理的盖玻片，每3 天换液。实验分组同前，于第15 天应用原位杂交技术检测各组型胶原的表达情况。     钙结节Vonkossa染色 诱导15 天后取出细胞爬片，PBS清洗3 次，2% AgNO3水溶液浸染，紫外线下处理30 分钟，蒸馏水洗1 分钟，5%硫代硫酸钠水溶液处理2 分钟后自来水洗5 分钟。 1.2.3  A-WMGC支架材料的生物学特性:本实验所用A-WMGC支架材料由由四川大学周大利教授提供。该材料采用溶胶凝胶工艺4,5制备，并通过造孔、成型及热处理等步骤。A-WMGC支

14、架材料为白色块状多孔物质，孔隙率40%50，孔径300400 m，孔道相互贯通。 1.2.4  A-WMGC支架材料修饰及体外实验设计： 将A-WMGC载体环氧乙烷消毒，扫描电镜观察。将载体分别置于24 孔培养板中。先后应用无水酒精处理48 小时，三蒸水处理36 小时, 12 小时换水1 次。使材料充分湿化。每孔分别加入多聚赖氨酸将材料充分浸泡2 小时，吸除多余液体，细胞培养箱内干燥，将传了3 代的成骨诱导的BMSCs制成浓度为4×106个/ mL细胞悬液,接种到装有载体的24 孔培养板中,移入CO2细胞箱培养4 小时后,在支架周围小心加入培养液,进行培养。分别于培养第3天

15、和第10天取出24 孔板内的载体，PBS洗3 次后，2.5%戊二醛固定，10%100%的乙醇梯度脱水，扫描电镜观察。 1.2.5  统计学分析：采用版本SPSS10.0统计软件进行处理分析，实验数据用±s表示，组间比较均采用重复测量的方差分析。2  结果 2.1  原代和传代培养时BMSCs的生长情况  原代BMSCs于2436小时开始贴壁,细胞为圆形，4872 小时后细胞形态为较一致的长梭形、纺锤形, 核较小, 呈椭圆形, 核浆比例小，45 天细胞集落形成, 逐渐增大,集落之间相互靠近。1014 天时集落边缘融合, 细胞呈较均一的旋涡状或螺旋

16、状分布。传代BMSCs在形态上与原代无明显差别。    2.2  兔BMSCs成骨诱导后形态观察  诱导后细胞自第3天可见部分细胞由长梭形逐渐变成长方形，并逐渐变为多角形，体积较诱导前增大，多角形细胞比例随着培养时间的延长而逐渐增高,见图1。 2.3  兔BMSCs的成骨诱导鉴定 2.3.1  各组碱性磷酸酶活性检测结果：非诱导组碱性磷酸酶有基础表达，但表达量低，随时间略有增加；地塞米松等诱导组第4天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无明显差别,随后碱性磷酸酶表达开始随时间的延长而逐渐升高，P<0.05,具有显著性差

17、异。 表1  成骨诱导组兔骨髓间充质细胞与非诱导组在不同时间点的碱性磷酸酶比较（略） *成骨诱导组与未诱导组比较，P<0.05,具有显著性差异 2.3.2  各组原位杂交技术检测型胶原结果：成骨诱导组检测型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒，见图2。非诱导组结果为阴性。 2.3.3  钙结节Vonkossa染色结果 ： 成骨诱导组Vonkossa染色可见钙盐沉积区域呈黑色钙结节，见图3。非诱导组结果为阴性。 2.3.4  未复合细胞A-WMGC载体的结构观察：未复合细胞载体在扫描电镜下观察，放大倍数为500倍时，可见材料呈孔隙均匀分布的网架结构，

18、孔隙表面光滑，孔隙率为4050，见图4。 2.3.5  细胞与修饰后A-WMGC支架复合的形态观察：复合兔骨髓间充质细胞后，扫描电镜下观察细胞在载体表面生长情况（第10天），放大倍数为500 倍。可见椭圆形的、多角形及不规则形的骨髓间充质细胞贴附于复合材料孔隙之间，见图5。    3  讨论    运用组织工程的方法修复组织缺损是近年来研究的热点,其中种子细胞的体外培养是研究的重点之一。骨组织工程研究要求有大量的来源稳定的种子细胞，自体或异体的成骨细胞往往取材困难，来源有限，骨髓间充质细胞具有多相分化潜能，且分化是

19、非定向的，但己经分化的间充质干细胞仍具有转化成其它类型间充质细胞的潜能6,7，因而，在一定诱导条件下，可使其向成骨细胞分化的数目增加，表明BMSCS具有很强的成骨潜能骨髓间充质细胞。向成骨细胞诱导的条件已经非常成熟,在培养基中加入地塞米松、甘油磷酸钠、维生素C就可以使之向成骨细胞分化8。已有研究将BMSCs种植于可释放地塞米松和维生素C的支架，并植入裸鼠体内，在体内形成矿化的骨组织9。    本实验中观察到地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化，自诱导第3天可见部分细胞由长梭形逐渐变成长方形，并逐渐变为多角形，细胞饱满，多角形细胞比例高，部分区域细胞呈现漩涡状分

20、布。第4天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无明显差别,随后碱性磷酸酶表达开始随时间的延长而逐渐升高,与非诱导组相比较有统计学意义。原位杂交检测型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒。Vonkossa染色可见钙盐沉积区域呈黑色，对照组为阴性反应。        作为多孔型骨修复材料，孔径、孔隙率及内部连通性是骨长入方式和数量的决定因素。研究认为549：孔隙率超过30以后，孔隙之间能够相互贯通，孔隙率越高越利于新骨长入，但孔隙率越高，多孔材料的强度显著降低。本实验采用的A-WMGC支架孔隙率在40%50，既使孔隙相贯通，又满足了临床应

21、用对力学性能的要求。此外，材料孔隙大小应满足骨单位和骨细胞生长所需空间。一般情况下，孔尺寸在200400 m时最有利于新骨生长。A-WMGC支架中23 m的微观孔隙与300400 m的宏观孔隙相结合，孔道联结贯通，孔隙结构适度，符合作为构建组织工程骨细胞支架材料的基本要求。    成骨诱导细胞与修饰后A-WMGC支架复合可见材料呈孔隙均匀分布的网架结构，孔隙表面光滑，孔隙率为4050。椭圆形的、多角形及不规则形的BMSCs贴附于复合材料孔隙之间，细胞充分伸展，向四周伸出伪足，分泌的细胞外间充质包绕于细胞周围。本实验应用的A-WMGC生物活性玻璃陶瓷多孔支架材料是一

22、种新型的生物复合载体，具有良好的生物活性、合适的力学性能和孔结构，实验中证实细胞在其上贴附生长良好，是优良的骨组织工程支架材料。    以后，我们将在此研究的基础上，把成骨诱导的细胞与A-WMGC支架复合植入动物骨缺损模型，观察A-WMGC支架体内降解性能及成骨情况，为生产可用于临床的组织工程化活性骨奠定基础。 【参考文献】  1 Kadiyala S，Young RG，Thiede MA，Bruder SP.Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic

23、potential in vivo and in vitroJ.Cell Transplant,1997,6(2):125-134.2 Kishimoto KN，Watanabe Y，Nakamura H，et al. Ectopic bone formation by electroporatic of bone morphogenetic protein-4 geneJ. Bone, 2002,312(4):340-347.3 Kohane DS, Langer R. Polymeric biomaterials in tissue engineeringJ.Pediatr Res, 2008,63(5):487-491.4 Kim BS, Baez CE, Atala A. Biomaterials for tissue engineeringJ. World J Urol,2000 ,18(1):2-9.5 Abiraman S, Varma HK, Kumari TV, et al. Preliminary in vitro and in vivo characterizations of a