成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精 - 伊红染色-

1、斑马鱼(Danio rerio模式生物的地位已在国际上被普遍认可,被广泛应用于开展发育生物学、基因组、蛋白组学及功能组学研究。近来,斑马鱼也逐渐在我国个别实验室登陆13。我们摸索出了成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红(HE染色的实验方法,兹将有关体会总结成文,供国内有兴趣开展斑马鱼研究的同行参考。1材料与方法1.1成年斑马鱼石蜡连续切片的制作1.1.1实验动物成年斑马鱼为市售野生型斑马鱼(体长大于3cm。1.2.1主要试剂无水乙醇;二甲苯;甲醛;伊红(0.5%和苏木素染料(Sigma公司;石蜡;Plank液(脱钙液,配方如下:氯化铝8g,盐酸10ml,甲酸6.5ml,蒸馏水100 ml

2、。1.1.3主要设备Thermo Shandon Excelsior组织处理机; Thermo Shandon Histocentre2型石蜡包埋机;Thermo Shandon Finesse325型切片机;Thermo Shandon Varistain Gemini全自动染片机;Thermo Shandon Consul全自动封片机。异无统计学意义(P>0.05。3讨论慢性应激动物模型是对应激反应、相关性疾病机制研究和防治的重要手段,应具备与人类应激性疾病的相似性、可重复性。应激刺激造成动物心理紧张状态,心理上的改变进一步影响生理功能;引起所谓“预警反应”是以交感神经肾上腺系统为中

3、心的一系列反应;导致应激性高血压疾病的发生,形成“应激性高血压动模型”。其机制与人类原发性高血压发病机制更接近。本实验采用的电击或电击结合噪声信号作为条件刺激,使应激心理成分大大增加,易化动物的心理反应,造成动物高血压。结果表明:(1我们采用的实验性应激源低频、低压交电电击足底或足底电击结合噪声的复合刺激诱导高血压动物模型是有效的,而且方法简易;(2复合应激源比单一应激源诱发高压大鼠的发生率更高。人类原发性高血压病是环境和遗传因素的相互作用而发病的多因子遗传性疾病,据报道75%高血压患者的疾病发生与应激有关3。建立适宜的动物模型对探讨这些疾病发生发展的复杂机制,寻求防治疾病的有效途径具有深远的

4、重要意义。参考文献1.王明辉,张淑熙.应激研究综述.信阳师范学院学报(哲学社会科学版,2003,23:5961.2.吕俊华,钟玲.实验性抑郁症动物模型的评价.中国病理生理杂志,2001,17:916919.3.郭金龙.应激医学研究进展.实用医学院杂志,2003,20:151152.(收稿日期:2005-05-20成年斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红染色袁广明胡黎平李燕陈大堤谢富康*(中山大学基础医学实验教学中心,广州510089【摘要】目的介绍斑马鱼石蜡连续切片的制作和苏木精-伊红(HE染色的方法。方法利用Thermo Shandon Excelsior组织处理机、Thermo Shan

5、don Histocentre2型石蜡包埋机、Thermo Shandon Finesse325型切片机、Thermo Shandon Varistain Gemini全自动染片机和Thermo Shandon Consul全自动封片机制作成年斑马鱼石蜡连续切片并进行HE染色。结果利用上述方法获得清晰的成年斑马鱼石蜡连续HE染色切片。结论斑马鱼石蜡连续切片的制作和HE染色与哺乳类动物组织切片和染色在操作和某些工作参数上有所不同。【关键词】斑马鱼;石蜡切片;苏木精-伊红染色基金项目:中山大学2005年实验室开放基金项目资助*通讯作者:E-mail:frankxie2000 图1斑马鱼分段示意图1

6、.1.4制作方法将成年斑马鱼禁食12h 后完整平展地浸泡于10%甲醛溶液中,于4冰箱固定12h 后,如图1示将整条鱼横切成头、胸腹、臀、尾四段。头段:将头段于10%甲醛溶液室温固定24h 后脱钙(Plank 液1d ,自来水冲洗1d 。用Thermo ShandonExcelsior 组织处理机按下列条件进行脱水、透明、浸蜡:75%乙醇、30,30min ;90%乙醇、30,10min ;95%乙醇、30,10min ;100%乙醇(、30,10min ;100%乙醇(、30,10min ;100%乙醇(、30,5min ;二甲苯(、30,5min ;二甲苯(、30,5min ;二甲苯(、30

7、,5min ;石蜡(、60,20min ;石蜡(、60,10min ;石蜡(、60,10min 。随后用Thermo Shandon Histocentre 2型石蜡包埋机进行常规包埋。继而用ThermoShandon Finesse 325型切片机切片,厚度4m 。胸腹段、臀段、尾段除不需要脱钙外,其它处理条件同头部。1.2成年斑马鱼连续石蜡组织切片的HE 染色步骤采用Thermo Shandon Varistain Gemini 全自动染片机按下列条件进行脱蜡、水化、HE 染色、脱水、透明:二甲苯(,15min ;二甲苯(,15min ;100%乙醇(,15min ;100%乙醇(,5mi

8、n ;95%乙醇,5min ;90%乙醇,5min ;80%乙醇,5min ;70%乙醇,5min ;蒸馏水,3min ;苏木素,5min ;流水,2min ;盐酸酒精,10s ;流水,40min ;蒸馏水,3min ;伊红,4min ;80%乙醇,2min ;90%乙醇,2min ;95%乙醇,2min ;100%乙醇(,3min ;100%乙醇(,3min ;二甲苯(,5min ;二甲苯(,5min ;二甲苯(,5min 。再用Thermo Shandon Consul 全自动封片机常规封片(图2、3。2结果通过摸索,我们染出了清晰的斑马鱼HE 连续切片(4m 。图2示成年斑马鱼头部组织H

9、E 染色切片,可辨别玻璃体、眼底各层结构以及脑组织等重要结构。图3示成年斑马鱼内脏组织HE 染色切片,可见消化道上皮(绒毛、胰腺外分泌部、胰岛、肝脏等组织和器官。3讨论3.1成体斑马鱼连续切片的制作体会要染出高质量的斑马鱼HE 连续切片(4m ,关键在于切片的制作过程。在进行整条鱼的连续石蜡切片前,首先要保证固定过程中鱼体的平展,避免鱼体弯曲,以方便后续的操作。在进行分段处理时,要选择鱼体自然的体表标志进行定位。本实验的三个横切位置选择在鱼鳃盖骨后缘的切线点、背鳍与身体的远端交点以及鱼体和鱼尾的移行点,从而将鱼体分为头、 胸腹、臀、尾四段(图1。其中,头部由于外围含骨质较高、内部组织松软,所以

10、在切片前必须脱钙。鱼头脱钙后冲水必须充分,否则会影响染色。由于我们要做的是4m 连续切片,要求每张切片结构必须完整。与陆生哺乳类动物相比,斑马鱼体小、内部脏器结构集中,尤其是胸腹部,包括心、肝、脾、鳔、肾、胰腺、消化道、胆囊等组织和器官,切片时极易碎裂。考虑到肝、脾的细胞体小、密集、纤维成分少、血管丰富而质脆的特点,我们在脱水、透明、浸蜡的处理过程中以肝、脾为基准,不断调节各步骤的时间,摸索出一套可以进行连续切片的处理方法。另外,在裱片时为了保持切片之间的连续性,我们在已包埋的蜡块右上角作一个三角形切口以作标记,以保证裱片的方向保持一致。3.2斑马鱼连续切片HE 染色的操作体会 为了确保染色质

11、量,要特别注意三点。其一,每次染片前,必须将苏木素和伊红过滤,将沉淀物和杂质除去;其二,二甲苯、酒精尽可能新鲜,特别是伊红后的80%、90%酒精必须是新鲜配制,否则影响切片的清晰度;其三,盐酸酒精分色要以脾、淋巴结等嗜碱性细胞较多的组织分色为准,同时兼顾其他组织。通过比较,我们所染切片的质量,与有关文献报道的图片相比毫不逊色4。值得强调的是,我们所作的是4m 连续切片。参考文献1.陆德祥.实验模式鱼-斑马鱼的繁殖技术.特种经济动图中黑箭头示消化道绒毛,白箭头示胰岛,弯箭头示肝脏图3成年斑马鱼内脏组织HE 染色切片×100图中黑箭头示玻璃体,白箭头示眼底,弯箭头示脑组织图2成年斑马鱼头

12、部组织HE 染色切片×50随着现代科学技术的飞速发展,医学领域里的检查和诊断技术得到迅速发展。特别是CT、磁共振(MRI、超声和断面扫描四大医学影像技术的出现,使疾病的诊断率得到极大的提高。作为其形态学基础的断面解剖学已成为人体解剖学的一个重要组成部分,掌握正常人体各部的断面结构对于医学影像、临床医学院等专业学生显得尤为重要1,2。在断面解剖学的教学科研中离不开解剖标本,因此,制作适合教学和科研需要的断面标本是解剖技术工作者的共同目标。然而,俗语道:工欲善其事,必先利其器。为身作更好的断面标本,就应该有更为适宜的制作工具,所以我们与大学物资设备处维修中心协作,对带锯机等制作工具进行了

13、完善,现就几点体会介绍如下。1完善带锯机及其配套设备我校于2000年年底购买了一台普通木工带锯机,在锯切时经常有锯口不走直线的现象,尤其锯切坚硬的骨质时偏斜更为明显,后在大学机械工程学院加工厂下料车间师傅的启示下,考虑上述现象发生可能与带锯机锯条硬度不够有关,后用材质更好钢条在校办工厂自制了新型的带锯机锯条,更换后以后问题就迎刃而解了,同时又在一定程度上减少了锯耗。与此同时,为了使制作出来的断面标本更均匀,我们还自制了标本进样器,尸体经钢丝固定,通过手摇螺杆控制前进距离,使切片厚度更为精确,在很大程度上克服了手工固定和机器振动所带来的层面厚薄不均、锯口偏斜等缺欠。当前已用于切割低温冻结尸体,制

14、作出了一批1cm厚度的断面标本,厚薄均匀度、断面光洁度等都能符合要求(图1。2改进有机玻璃盒制作工具制作精美的断面影像解剖学标本,采用有机玻璃盒装,对增强标本的结构显示和外形美观有很大的作用,并能经久耐用,长久保存。有机玻璃平板是甲基丙烯酸甲酯单体聚合的典型产品,具有一系列优异的理化特性,光学性能透光率为92%,有较高的机械强度及热塑加工性能,耐酸、耐碱、耐腐蚀能力强。根据有机玻璃特性,可顺利地制作出各种理想的标本盒。制作有机玻璃标本盒的基本过程包括:切割取材、弯曲成型、磨削平整、接口粘合、抛光打磨等过程。以往我们裁切有机玻璃盒常用电动盘锯,切割速度要求较高,太快易卡锯、太慢则可使锯片受热变软

15、以致锯切面不直,所以我们将原有的钢锯片改装成砂轮片,使以上问题得到很好解决,在操作台两端分别加上标尺,使切割尺寸得以保证。同时,我们还将直槽电炉设计成“对合型“(上下均受热,提高了受热效果,以便更好地弯折与压型。粘合面磨削平整是制作有机玻璃标本盒操作要求较关键的工序。以前使用的木工锉、木工刨、砂布等不但费时费力,而且磨口也不平整,而砂轮机、平磨机的砂轮和砂布打磨,需要给以一定外力才能完成磨削工序,受力的大小及均一与否是问题的关键,其可直接影响平整的效果,而且平磨机的铸铁平面一旦磨损更换也很困难,为此我们用旧落地钻进行改装,使铸铁平面固定,并在其上方加上旋转砂轮片,通过砂轮片旋转使接口磨平更精确、光滑。3摸索缝口连结的技巧有机玻璃标本盒接合缝的连接方法有溶接法、粘接植物,2004,3:1617.2.吴玉萍,熊茜,张广献,等.斑马鱼基因工程的研究进展.遗传学报,2004,31:11671174.3.王跃祥,钟涛,宋后燕.斑马鱼发育遗传学