NF-kB 炎症相关肿瘤的启动因子

1、NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子,目前关于致癌物质的研究比较多,但 关于慢性炎症所致肿瘤形成的分子机理尚不十分清楚。 PIKARSKY 应用 the Mdr2-knockout mouse (自发性胆汁郁积致肝癌模型 ,发现肝内皮细胞和炎细 胞通过上调肿瘤坏死因子引发 NF-kB , NF-kB是在慢性炎症相关肿瘤形成过程中不可缺少的因子, 可能为慢性炎症所致肿瘤的 预防提供可能的靶点。我们还不清楚人类癌症的起因, 但是, 可以估计到, 致癌物质的检测和慢性 炎症是肿瘤发展的两个潜在条件, 慢性炎症能够解释约 20%的人类癌症 1。 因此, 致癌物质的检

2、测和癌症之间的因果关系已被广泛研究 2。 关于慢性炎症所致肿瘤 发生的分子细胞机理仍不十分清楚。我们知道,在肿瘤中检常能测到核因子度环节。为了验证这一假设,我们研究了敲除 Mdr2基因的小鼠品系,能够通过 肝细胞癌自发发生胆小管性肝炎 6,它是一种炎症与癌症相关的典型例子 7。我 们观察了敲除 Mdr2基因小鼠的肝炎和癌演进,结果显示,在邻近的内皮和炎症 细胞中,随着肿瘤坏死因子的上升,炎症过程能够触发肝细胞中的 因子。 在七个月鼠龄的小鼠中,通过使用一种特殊肝细胞可诱导的超级转基因抑制物 IkB , 来阻断 NF-kB , 这种抑制物对肝炎和早期肝细胞转化都无影响。 作为对照, 通过抗肿瘤坏

3、死因子的治疗或在肿瘤发展的后期阶段, 使用具有 IkB 的超级抑制 物进行诱导,来抑制 NF - kB的作用,导致转化的肝细胞发生细胞凋亡,破坏肝 细胞癌的进展。因此,我们的研究表明, 能促进炎症相关的癌症, 因 此,是一种为慢性炎症所致癌症的预防提供潜在靶点。肝癌是引起全世界癌症死亡率的第三大原因, 通常是在慢性炎症的基础上发 生 8。根据在敲除 Mdr2基因小鼠中的肿瘤发展,我们已经证实了前期已开展实 验的结果 6, 9,这和人类的肝癌非常相似,包括以下几个不同时期:炎症,异 型增生,不典型增生结节(腺瘤样,癌转移(附图 , 。在敲除 基 因小鼠中,肝炎是疾病的最早迹象,其特点是广泛的导管

4、和汇管混合炎性浸润, 在 阳性细胞中最丰富(附图 。NF-kB 的活性常在人类肝癌中被检测到, 尤其是在肝炎中 8。 根据 RelA (p65免疫染色, NF-kB 的活性可能与敲除了 Mdr2的肝癌形成有关 (Fig. 1a。 细胞核 染色表明, NF-kB 的活性在基因敲除小鼠的所有年龄中都很明显。但在正常、 年龄匹配的小鼠,这促使研究 NF- kB活性在基因敲除小鼠的来源。在一些肿瘤, 如霍奇金病和某些淋巴瘤, NF - kB的活化具有一种内在的,肿瘤自发的特点, 可能与它的信号通路中的突变有关 10。如果类似机制发生在 Mdr2敲除的肝癌, 在所有肿瘤的肝细胞中,人们会观察核 NF-

5、kB发生活化。然而,这并非如此 ; NF - kB的活化在实质中是分散的,主要是靠近有炎症的肝门(图 1e 中,左图,这 意味着一个炎症引起的现象。 为了评估这种可能性, 我们给基因敲除和野生型小 鼠饲喂非甾体抗炎药(NSAID 布洛芬 10天。通过组织学分析(图 1b ,这种 治疗方法能明显导致炎症减少,显着降低血清谷丙转氨酶(ALT ,一种肝细胞 损伤标志物(图 1C 及中性粒细胞减少(图 1C , D 。 p65的免疫染色结果表 明,在类固醇消炎药治疗组的肝细胞 NF - kB的活化程度明显低于对照组。与此 相反,在腹腔内的肿瘤坏死因子作用下,布洛芬并没有对肝细胞 NF kB活性产 生影

6、响 (数据未显示 。因此,在基因敲除肝细胞中,似乎由炎症细胞引起的在肝炎中, TNFa 是一种类似 NF-kB 活性的介质,特别是它对细胞膜形成的 作用,在基因敲除的肝脏中,属于正调节 (Fig. 2a。为了研究这一可能性,我们 用具有中和作用的抗 -TNFa 抗体处理基因敲除的小鼠三天,然后进行分析肝细胞 中 NF-kB 的活性。 抗肿瘤坏死因子的治疗能消除肝细胞 p65的核染色 (图 2b , 进一步确定了 NF - kB的活化主要由 TNFa 诱导的预测。 要确定肝炎中肿瘤坏死因子的来源,我们把肝细胞分为野生型和基因敲除型(80%苏木纯度和 -曙红(H &E 染色 及其他细胞(2

7、%肝细胞 。通过实时定量 PCR 分析 TNFa 表达的两种成 分,已经确定 TNFa 的主要来源于无肝细胞部分,基因敲除型小鼠比野生型小鼠的细胞和 NF-kB 活性间的关系,肝切片分别 。 TNFa 表达主要在肝门静脉处被检测到, 包括 内皮和炎症细胞 (Fig. 2d。 由 p65 染色的肝细胞核主要位于 TNFa 阳性的肝门静脉 处 (Fig. 2f,这表明肝细胞 NF-kB 主要经 TNFa 旁分泌的刺激引起活化。为了验证 TNFa 的产生者并能区分他们哪些是来自结合 TNFa 的细胞,野生型的肝切片和用 布洛芬处理过的基因敲除小鼠肝切片分别通过 mRNA 的原位杂交进行分析。 和免

8、疫染色的数据非常相似,在基因敲除小鼠的内皮和炎症细胞中,我们发现 TNFa mRNA 呈过高表达状态,野生型和用布洛芬处理过的基因敲除小鼠则很少表达。 在基因敲除小鼠和野生型小鼠的肝细胞中,几乎检测不到 TNFa 的表达 (Fig. 2e. 在基因敲除的肝细胞中,我们经常能检测到 的活性,这表明炎症相 。 为了能直接评估 NF-kB 在肝癌形成中 的作用,我们用携带了两个转录基因的 D N-I k Bhep 小鼠繁殖了 Mdr2基因敲除 的小鼠:一个是由调节四环素的启动子控制的非降解 D N-I k B ,另一个是由特异 性肝细胞 C/EBPb启动子 (TALAP111控制的四环素反转录因子。

9、调节四环素的 启动子也指导荧光素酶的表达,所以,可以用具有活性的小鼠荧光素酶 11来检 测转基因表达水平和组织特异性。根据具有 Mdr2基因敲除的双转基因的 DN - IkBhep 小鼠与 Mdr2敲除小鼠产生 Mdr22 / 2的 DN - IkBhep(双突变小鼠服 从 NF - kB的调节。 将来自具有抗荧光素酶抗体的相同的动物的肝脏进行免疫组 织化学染色,结果表明,只有肝细胞表达转基因,而不是胆管上皮细胞, (Supplementary Fig. 2a。因 处理的小鼠中, p65 免疫染色检测到许多阳性的肝细胞核 , 但在未经处理的双 突变小鼠中则没有检测到 (Supplementar

10、y Fig. 2b, c。 在基因敲除小鼠和双突变小 鼠 (不分多 Dox (多西环素 (结果未显示 染色呈阳性的胆道细胞和 Kupffer cells 都能被检测到,证明转基因在抑制 活性方面具有特异性和有效性。 因为,在敲除 Mdr2小鼠中,肝炎起始于胆道系统 6,它不应该受到特异性 肝细胞 D N-I k Bhep 的影响。然而,在评估 NF-kB 在肿瘤形成中的作用之前 , 我 们想要排除在炎症形成过程中任何可能抑制 NF-kB 的可能性因素。与那些年龄 匹配的野生型小鼠相比, 基因敲除小鼠和双突变小鼠都有较高的 ALT 水平 (Fig. 3b 。将各组所有年龄的小鼠肝脏进行组织学分析

11、,结果显示,和非化脓性胆管 炎类似, 肝门静脉扩张是由于胆管增生, 一种混合性的肝门静脉炎性浸润和轻度 至中度纤维化 (Fig. 3a。 在肝门束和肝实质。 这两个品系具有大量的阳性 CD3和 阳性髓过氧化物酶(MPO 细胞。因此, 好像 Mdr2敲除小鼠的基本炎症过程 主要维持在双突变小鼠,与肝细胞的 NF - kB活性无关。Mdr2敲除肝细胞和野生型的区分主要依据几个异常功能:高增殖率,高染 色体倍数和异常增生。而第一点也是肝损伤和部分肝切除的特点 12,异型增生是恶化前的条件 13。 肝细胞增殖由溴脱氧尿苷 (BrdU 标记和 Ki - 67抗原染色 进行测定。 与野生型小鼠相比, 这两

12、种标记在基因敲除和双突变小鼠中明显增强 (图 3b 。与以往研究的相同点 14, 15, NF - kB的缺乏不会导致肝细胞增殖:在任何年龄的基因敲除和双突变小鼠中,无论 BrdU 标记还是 Ki - 67染色都没 有明显的差别。肝细胞异常增生有两大特点,组织破坏和细胞学异型性。组织学分析显示, 在基因敲除和双突变小鼠中, 红细胞大小不均是一个显著特点, 在所有动物品系 中, 4个月时,异常增生非常明显, 7个月后,异常增生会明显增加。在基因敲 除和双突变小鼠任何年龄组之间, 我们还不能检测到异常增生的宽度或深度 (Fig. 3c 。以年龄相匹配的野生型小鼠作为对照,我们尝试量化分析肝细胞癌前

13、变化, 并分析两个品系的肝细胞染色体倍数。 从肝脏中分离的细胞核用碘化丙叮进行染 色,用荧光活化细胞分选系统 (FACS检测。两组都有高程度的染色体倍数,我 们注意到,在 4或 7个月的基因敲除和双突变小鼠中,细胞周期增殖之间没有显 着性差异(图 3b 。发现基因敲除和双突变小鼠显示差不多的增殖程度,高倍染 色体和异常增生暗示 NF-kB 在肿瘤形成的早期不是必须的。然而, NF - kB的抑制物对肿瘤早期阶段并没有影响,大龄小鼠的磁共振成 像 (MRI和组织学分析能清晰地辨认出基因敲除小鼠、经 Dox 处理的小鼠和未经 处理的双突变小鼠(NF-kB缺乏。在 10个月, 60%和 78%的基因

14、敲除小鼠和 经 Dox 处理的小鼠分别有肝癌, 而只有 10%未经处理的双突变小鼠发生肝癌 (P < 0.01, Fig. 4。 因此,消除肝细胞中 NF-kB 的活性能减少肿瘤的发生。当比较这 两个小鼠组的每只小鼠的肿瘤数量的平均值时,在 NF - kB缺乏动物中的类似的 肿瘤抑制作用引起了人们的注意(数据未所示 。7个月, 在基因敲除和双突变小鼠的肿瘤发生早期仍没有观察到差别:两组都没有 探测到肿瘤,仅有一些发育不良的实质。因此,在第 7个月,我们去除转基因, 恢复肝细胞中 NF-kB 的活性。使用 MRI 检测肿瘤发展,进行 3个月。令人惊讶的 是,在这三个月期间,饲喂 Dox (

15、NF-kB proficient的 9只小鼠,有 7只能够用 MRI 探测到肿瘤。在适当的鼠龄,来自基因敲除的这些肿瘤都不能区分大小 (Fig. 4b及组织学外观(数据未显示 。因此,似乎 NF kB在癌前病变的早期阶段可有 可无(即肿瘤开始,但这对肿瘤的后期发展有必要。 11和基 NF-kB 的抗细胞凋亡的 作用能促进 IkB 超级抑制物的抑制肿瘤效应。为了研究这一可能性,我们对有活 性的半胱天冬酶 -3使用免疫染色来评估细胞凋亡。在第 7个月,与野生型肝脏相 比,基因敲除的肝脏(其中有大部分肝细胞是发育不良的 ; Fig. 3c显示更多的 细胞凋亡, 可能是由于炎症的毒性效应 (Fig.

16、5a。 然而, 阻断肝细胞中的 NF kB, 结果能诱导三倍多的肝细胞凋亡。值得注意的是, 通过抗肿瘤坏死因子的治疗, 能达到一个类似的效是。 两者 合计,我们的结果表明, NF - kB的抑制物通过促进已转化的肝细胞发生凋亡来 发挥其肿瘤抑制效应。NF - kB调节多种抗凋亡基因,其中一些可能与肝细胞转化有关。为了确定 有关的靶基因和证实 TNFa NF-kB 的活性联合亲致瘤作用,通过 RT PCR (RT - PCR 法和 Western blot分析后选基因的表达。然而,一些已验证的靶基因 (forexample, XIAP, 在 NF kB存在和缺乏的肝脏中表达很相似, A1/Bfl

17、1, c-IAP1 和 GADD45b 在基因敲除的肝脏中明显增加 (Supplementary Fig.3a, b。 一致的是, 在 基因敲除小鼠中,抗 -TNFa 处理能阻止 GADD45b 和 A1/Bfl1的诱导 (Fig. 5b。 可以想象, 在肝脏, 炎症过程能通过两个互相补充的臂促成肿瘤的发生 (Fig. 5d DNA 复制 容易出错,而且能通过遗传毒性因子进一步改变肿瘤的形成 18,其中有许多毒 性因子在肝脏中有明确的活性(例如,黄曲霉素 19。此外,肿瘤的促成需要 第二个臂,能通过 NF-kB 的活性为细胞凋亡提供保护作用。我们的数据表明,肿 瘤坏死因子是抗细胞凋亡臂的主要推

18、动力,这对依赖性抗凋亡基因才能激活的 NF kB来说是必要的,如 A1/Bfl1和 c - IAP1和 GADD45b 。尽管在疾病发生的早 期阶段, NF kB是有活性的,但在长期的过程中,它是不必要的。在此期间, 癌前病灶积聚在发炎的肝脏, 但在这些病灶转向恶性的阶段中至关重要。 可能在 肿瘤发展阶段获得的致癌突变体致使癌变前的肝细胞对能够消除 NF-kB 活性的 细胞凋亡因子十分敏感。假定在脆弱肿瘤的发展阶段的凋亡调控因子是 p53和 cJun (ref. 20, TNF 受体家族成员 21和 cJun 氨基末端激酶(激酶 22。 在 7个月 的基因敲除的肝细胞中,能检测到 JNK 的活

19、性和 cJun 的表达增加 (Fig. 5c and Supplementary Fig. 3a,围绕癌前高峰期变化(图 3 。和 NF kB相似,这些都是 依赖于连续肿瘤坏死因子的信号, 像基因敲除的小鼠的抗肿瘤坏死因子治疗, 抑 制肝脏 JNK 的活性和肝细胞 cJun 基因的表达(图 5b 中的 C 。通过 NF - kB的靶点 GADD45b , JNK 的活性易受 NF - kB的抑制物的影响(参 23, 24胞凋亡 (Fig. 5b,并能通过多倍 NF-kB 介导的抗细胞凋亡基因的抑制来促进半胱 天冬酶介导的肝细胞凋亡 (Supplementary Fig. 3。同时,由抗肿瘤坏死

20、因子治疗 (图 5c 的 cJun 抑制物能够促进 p53介导的细胞凋亡 20。因此,在慢性肝炎患者 中,通过抑制多抗凋亡途径(Fig. 5d ,抗肿瘤坏死因子治疗可作为预防人类肝 癌的潜在模式。最近,有关结肠炎症模型的研究支持了我们的结论,其中在肿瘤发生阶段, 结肠 IkB 的激酶 B (IKKb 的失活能导致上皮细胞凋亡 25。而炎症释放多种生 长因子和细胞因子类 1, 26,我们的数据表明,肿瘤坏死因子具有激活的核心作用, 并能保护已转化的肝细胞对抗细胞凋亡。 有人提出, 如果旨在消除 引起信号异常的原因, 而不是仅仅处理最后的结果, 或许抗癌研究会更有效 27。 鉴于根除的首要原因,

21、例如慢性肝炎, 目前很难达到, 破坏肿瘤发展不断产生的 信号,可能是一个更现实的目标。我们发现,短期消除上皮 的活性能诱 导癌变前的细胞凋亡和制止肿瘤发展, 足够支持这个猜想。 一大信号因子的间歇 性抑制,如 NF - KB或肿瘤坏死因子,因此可以成为一个延长癌前阶段的工具, 并能在具有高风险癌症发生的慢性炎症性疾病中,抑制肿瘤发展。Methods以下内容能在参考文献中找到:试剂,转基因小鼠的构建和基因型分析, RT PCR , real-time PCR ,原位 mRNA 杂交 , 肝细胞分离, western blot和肝细胞高倍染色体分析。Animal studies and tissu

22、e preparation所有的动物实验是在按照委员会制定的政策下执行, 研究用的动物小鼠用致 命麻醉剂量处死。 在体内荧光素酶成像和多西环素治疗按照参考文献 11所描述的 那样执行。 用 20 ng人类 TNFa 重组体 (Roche进行动物腹腔注射, 1h 后, 处死小鼠,取出肝脏,进行 p65免疫染色和 RNA 和蛋白提取。对于抗肿瘤坏死因子的治疗, 小鼠腹腔注射 22 mg山羊抗小鼠肿瘤坏死因子的中和抗(R&DSystems;AF-410-NA,连续 3天,或用山羊 IgG 作为对照。所有的小鼠进行 腹腔注射 BrdU (Amersham; 100 ml per 10 g bo

23、dy weight 3和 24小时后, 处死小鼠。 对于一些动物,取出肝脏样品,速冻,进行蛋白质和 RNA 分析。用 10毫升的冷 肝素 PBS 通过左心室灌注该动物,其次再用 4%的福尔马林缓冲液灌注 25毫升。 取出肝脏,称重,拍摄,在夜间用福尔马林固定。第二天,将整个肝脏用石蜡包 埋在三到五个包埋盒里。 制成 5毫米切片并用 H &E 染色, 然后让不知道它的遗传 组成和处理组的病理学专家分析切片。MRI analysis用一个水平 4.7T Biospec谱仪(BrukerMedical 做 MRI ,使用鸟笼线圈。小 麻醉鼠(30毫克 /kg21巴比妥, i.p. 和使小鼠仰

24、卧并使肝脏位于线圈的中心。通 过多层日冕和轴向 T1,加权快速自旋,覆盖整个肝脏冠向和轴向的回波图像, 来测定肝脏和肿瘤体积(重复时间, 400毫秒 ; 回波时间, 17毫秒 ; 切片厚度, 1毫米 ; 视野, 5厘米(冠状和 3.4厘米(轴向使用 256 ×256矩阵。由一个 不知道其基因组成的观察员通过图像处理软件(NIH 图像来概述每个切片可看 见的肝脏和肿瘤的边界, 从而估计肿瘤和肝脏的体积, 改变像素数 (适用于肝脏 和肿瘤调到一个面积乘以系数(视野 2×(矩阵 2。 Immunohistochemistryp65染色,在同一天制备 5毫米切片,用不同浓度的酒精打蜡和水化,在高 压锅里用 pH6.0的 25mM 柠檬酸盐缓冲液煮沸, 115, 3分钟 (decloaking chamber, Biocare Medical,转移到沸腾上午去离子水, 降温 2