悦肝胶囊对酒精中毒小鼠肝脏保护作用的组化和生化研究(一)

1、悦肝胶囊对酒精中毒小鼠肝脏保护作用的组化和生化研究(一)    作者：朴丽花， 金政， 蔡英兰， 李善花 【关键词】 悦肝胶囊；,酒精性肝损伤；,组织化学；,生物化学摘要：目的：研究悦肝胶囊对酒精性肝损伤小鼠肝脏的保护作用。方法：KM种小鼠随机分正常组、模型组(56度二锅头白酒14 ml?kg-1?d-1)、东宝肝泰组(0.8 g?kg-1?d-1，56度二锅头白酒14 ml?kg-1?d-1)、悦肝胶囊大剂量组(10 g?kg-1?d-1，56度二锅头白酒14 ml?kg-1?d-1)、悦肝胶囊中剂量组(5 g?kg-1?d-1，56度二锅头白酒14

2、m1?kg-1?d-1)、悦肝胶囊小剂量组(2.5 g?kg-1?d-1，56度二锅头白酒14 ml?kg-1?d-1)、连续灌胃6周,眼球采血，进行生化测定丙氨酸转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)；取出肝左叶按组织化学方法观察琥珀酸脱氢酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)活性，油红O法显示中性脂肪。结果：悦肝胶囊可明显抑制ALT活性巴(P0.05)，降低TG、MDA含量(P0.05)，提高SOD活性(P0.05)；组织化学观察表明，损伤组SDH活性下降，ACP活性增高，脂滴增多。悦肝胶囊可减轻上述肝损伤程度。结论：悦肝胶囊对酒精中毒小鼠肝脏损伤有一定

3、的防治作用。关键词：悦肝胶囊； 酒精性肝损伤； 组织化学； 生物化学据文献报道1,酒精性肝病的发病率与酒精消耗平行,饮酒量越大其发病率越高，酒精中毒对肝脏的损害较其它组织、器官更严重，悦肝胶囊主要由葛根、丹参、西洋参、麦冬等中药组成。临床资料表明此方具有改善肝炎患者症状、恢复肝功能、调节免疫功能的作用。为探讨悦肝胶囊的作用机理本实验观察了悦肝胶囊对酒精所致的肝损伤小鼠血清氧自由基相关指标及其对肝细胞酶活性变化的影响。1 材料和方法1.1 实验动物KM种雄性小鼠，体重为（20±2）g，延边大学医学院实验动物科提供，于室温1820 普通饲料喂养，自由摄食、饮水。动物合格证：SCXK200

4、2-2005。1.2 药物与试剂悦肝胶囊由延边大学长白山天然药物研究中心提供。制备方法：葛根30 g,丹参30 g,麦冬20 g,西洋参20 g,加蒸馏水煮1 h后过滤，滤出液备用，把原药再煮1 h后过滤，把第1次滤出液和第2次滤出液混合，浓缩成100 ml即得。实验用酒为北京二锅头酒厂生产的56度二锅头白酒。东宝肝泰为中国通化东宝药业股份有限公司产品。ALT，TG试剂盒为中生北控生物科技有限公司产品。SOD，MDA试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。1.3 主要仪器日本OLYMPUS万能显微镜，芬兰MK-3酶标仪，德国ZKl5超低温高速离心机，北京天地百年科技有限公司TD一2000真彩色病理

5、细胞显微分析系统，美国Starlet221恒冷箱切片机。1.4 方法将60只KM种小鼠随机分为正常组、酒精损伤组、东宝肝泰组、悦肝胶囊大剂量组、悦肝胶囊中剂量组、悦肝胶囊小剂量组。药物对照组给予0.8 g/kg体重东宝肝泰，药物组分别给予10，5，2.5 g/kg 体重悦肝胶囊，正常组、模型组以等体积生理盐水灌胃，30 min 后除正常组外其余组均给予56度二锅头白酒14 ml/kg体重灌胃。小鼠连续灌胃6周，于末次灌胃24h ，眼球采血，分离血清，用酶标仪测SOD活性和MDA含量；快速断头处死小鼠，取出肝左叶进行组织化学观察。1.5 观察指标ALT活性采用赖氏法；TG含量按酶比色法；血清SO

6、D活性按黄嘌呤氧化酶法；MDA含量按硫代巴比妥酸法。肝组织冰冻切片，切片厚约8 m，进行组织化学染色。亚铁氰化钾法显示琥珀酸脱氢酶，Gomori法显示酸性磷酸酶活性，油红O法显示中性脂肪，在万能相差显微镜下观察并拍片。1.6 统计学方法所有数据以±s表示，应用SPSS10.0统计软件进行方差分析。2 结果2.1 组织化学2.1.1 琥珀酸脱氢酶(SDH)染色结果SDH活性在光镜下显示为紫蓝色颗粒。正常组SDH活性强，颗粒多，染色深。模型组SDH活性减弱，紫蓝色颗粒减少，染色浅。药物对照组及药物组SDH活性均较模型组增强，颗粒多，染色深。2.1.2 酸性磷酸酶(ACP)染色结果ACP活

7、性呈棕黑色沉淀。正常组ACP活性弱，酶颗粒染色较浅，均匀一致。模型组ACP活性增强，颗粒多，染色深。药物对照组与药物组ACP活性均减弱，颗粒染色较浅。2.1.3 中性脂肪用油红O法染色，在正常小鼠肝细胞内可见少量桔红色的圆形脂滴，而模型组小鼠肝细胞内显示较多的大小不一的圆形脂滴。悦肝胶囊组脂滴减少。2.2 血清学改变见表12。表1 各组血清ALT，TG比较（略）与正常组比较，#P0.01，与损伤组比较*P0.01表2 各组血清SOD活性和MDA含量比较（略）与正常组比较，*P0.05，与模型组比较，#P0.053 讨论酒精性肝病是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病。现代医学认为其可能的发病机制为机

8、体的免疫反应异常，自由基的产生和脂质过氧化，生物膜的损伤，肝细胞代谢紊乱等2。在本实验中观察到酒精性肝损伤时肝血清内ALT活性和TG含量有明显变化，其酶活性和含量变化可反映酒精导致肝损伤的严重程度。酒精中毒引起的肝损伤与酒精的代谢产物乙醛的直接毒性有关34，乙醛可使肝细胞内线粒体受损，而使肝细胞对脂肪的分解功能低下，此时机体可动员皮下脂肪组织的脂肪酸向肝内转移，致使血清TG含量增高。本实验结果表明：模型组与正常组、东宝肝泰组、悦肝胶囊组相比较血清TG含量均有显著差异，P0.01；组织化学染色显示损伤组肝细胞内可见较多的桔红色脂滴沉着，其余各组均见少量脂滴。说明悦肝胶囊对肝脏脂质代谢起到一定的调

9、节作用，可能主要通过悦肝胶囊中的丹参促进了脂肪在肝中的氧化作用，从而降低了肝脂的含量5。ALT主要分布于线粒体内，且其活性是肝细胞损害的敏感指标6。当肝组织发生损伤或炎症时，因能量障碍而致细胞膜通透性增加，使肝细胞内的转氨酶释放入血引起血清转氨酶活性升高，并在一定程度上反映肝细胞坏死和损伤程度7。悦肝胶囊可明显降低酒精所致肝损伤的ALT升高，具有恢复肝功能作用。 超氧化物歧化酶(SOD)作为体内重要的抗氧化酶，它能使超氧化物阴离子自由基变为过氧化氢和氧离子，从而减少脂质过氧化反应，使机体细胞和组织免受损伤。当机体氧化系统和抗氧化系统失衡时就会产生大量的自由基，最终形成过氧化脂质的分解产物之一是

10、丙二醛(MDA)，因此通过测定MDA可以间接反映体内自由基产生和损伤程度，可以说自由基所引起的脂质过氧化反应仍是诱发酒精性肝损伤的重要原因之一8。酒精性肝损伤的组织损伤与SOD、MDA之间存在密切关系。本实验结果表明：模型组与正常组、东宝肝泰组、悦肝胶囊组相比较SOD活性、MDA含量均有显著差异，P0.05。说明酒精引起的肝损伤中有大量自由基产生，悦肝胶囊能使酒精性肝损伤小鼠肝血清SOD活性增强，抑制MDA活性，并使之含量降低，可能与方中西洋参的抗氧化作用有关9。陈子馨等10提出酶组织化学是在研究酒精性肝损伤中具有早期及特征性的指标，是必不可少的重要检测手段。琥珀酸脱氢酶(SDH)是在柠檬酸循

11、环中，催化琥珀酸与延胡索酸之间反应的一种酶。它存在于所有有氧呼吸细胞的线粒体内膜，是线粒体内膜的标志酶。SDH活性的变化与线粒体损伤同时出现，与线粒体的数目平行升降。因此，SDH可代表线粒体能量代谢，SDH的活性变化可作为线粒体损伤程度检测的敏感指标之一。酸性磷酸酶(ACP)主要存在于溶酶体内，是溶酶体的标志酶，当溶酶体膜受损、膜的稳定性降低时溶酶体膜的通透性增强，屏障作用减弱，致使ACP等水解酶渗入胞质，酶活性增强11，一方面参与吞噬消化变性坏死结构，另一方面水解正常细胞结构，加速细胞变性坏死过程。本实验在灌入酒精后，SDH活性明显降低、ACP活性则明显增强。而悦肝胶囊却能使SDH活性增强，

12、抑制ACP活性。说明悦肝胶囊可能通过减轻线粒体损伤和保护溶酶体膜而对肝脏起到保护作用。其确切的机理有待于进一步研究。悦肝胶囊中的葛根12，13可健脾化湿，疏肝活血，生津解渴，增加脑及冠状血管血流量的作用，是民间百姓解酒毒的常用药；丹参解酒泻毒，理气运脾，活血化瘀，具有保肝降酶，减轻肝细胞变性坏死，为解酒保肝药；西洋参、麦冬、五味子起到辅助解酒的作用，诸药合用具有解酒醒脾、益气养胃的功效。并通过促进肝脏脂质代谢，制脂质过氧化，提高抗氧化酶活性，起到保肝作用。通过本实验证明悦肝胶囊有明显的保肝作用，为寻找有效的抗ALD的中药制剂提供了实验依据。参考文献：1 高荣慧.葛花汤治疗酒精性肝损伤82例J.

13、中国民间疗法，1996，4(1)：3939.2 陈宏慈，吴 勇.中医药治疗酒精性肝病的临床与实验研究概况J.湖北中医杂志，2000，22(1)：5l53.3 杨献英，邵振鸿，杨万里.中药清开灵注射液防治小鼠酒精中毒性肝损伤J.华人消化杂志，1998，6(10)：847849.4 大西久仁房.酒精与肝病J.日本医学介绍，1997，8(1)：67.5 陈全寿，卢聚沛软肝消水汤治疗酒精性肝硬变腹水25例J.浙江中医杂志，1995，30(4)：149149.6 田德录，叶永安，杨慧民.中药慢肝消治疗酒精性肝痼的临床研究J.华人消化杂志，1998，6(11)：945947.7 梁扩寰.肝脏病学，第1版M.北京：人民卫生出版社，1995:208208.8 河福金，贲长恩，王德福.小柴胡汤对大鼠酒精性肝损伤防护作用的组化和生化研究J.北京中医药大学学报，1997，20(1)：4547.9 马春力，李福全，赵玉珍，等.西洋参茎叶皂甙对急性乙醇中毒大鼠肝损害的影响J.佳木斯医学院学报，1992，15(6)：1818.10 陈子馨，王泰龄，赵静波.酒精