新型发酵蔬菜制品乳酸菌发酵剂的筛选研究

1、第19卷 第3期 宁波大学学报(理工版V ol.19 No.3 2006年9月 JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY ( NSEE Sept. 2006收稿日期:2006-04-30.基金项目:国家星火计划项目(2005EA701026;宁波市科研基金(2004C100037. 文章编号:1001-5132(200603-0316-05新型发酵蔬菜制品乳酸菌发酵剂的筛选研究刘 璞,翁佩芳,吴祖芳(宁波大学 生命科学与生物工程学院,浙江 宁波 315211摘要:从榨菜等一些自然腌制蔬菜制品中分离得到一些乳酸菌菌株,通过细胞形态及生理学特性观察研究,初步筛选出Lactobaci

2、llus 8株菌株. 并进一步通过发酵产酸和细胞生长比较实验得到3株乳酸菌菌株Lact .2,Lact .6和Lact .8,通过菌株间不同配比和发酵榨菜验证实验,最后确定了榨菜发酵制品的最适发酵剂为Lact .2和Lact .8,最佳配比为1:1. 关键词:乳酸菌;分离;筛选;发酵;榨菜中图分类号:Q939.11文献标识码:A传统的蔬菜腌制是利用高盐浓度的渗透作用及乳酸菌在蔬菜中的生长代谢,主要是乳酸发酵作用,赋予腌菜特有的风味. 但目前,浙江地区蔬菜腌制产品工艺依然停留在自然腌制发酵水平,发酵周期长,生产过程不易控制及易引起环境污染等一系列问题,腌制过程中的杂菌尤其是硝酸盐还原菌,能够产生

3、亚硝酸盐等对人体有害的物质1,导致腌菜企业难以实现标准化、规模化生产,直接影响企业的经济效益和进一步发展.由于蔬菜腌制加工中采用乳酸菌发酵技术对产品的营养价值、食用品质及其产生的环境和经济效益等诸多方面带来的显著效果2,近年来,乳酸菌接种发酵工艺已引起腌菜企业的高度重视,通过接种一定量的乳酸菌发酵剂,发酵产酸使腌制发酵初期pH 迅速下降,抑制有害杂菌,尤其是抑制亚硝酸盐还原菌等的生长,使发酵能够正常进行,并赋予制品浓郁的香味和丰富的营养,因此,筛选出合适的乳酸菌发酵剂是亟待解决的首要问题. 本实验从常见的腌菜中筛选出发酵性能优良的乳酸菌,考虑菌株间存在的互生作用,以一定比例混合配比,优选新型乳

4、酸菌发酵剂,为其在榨菜等生产中的应用创造有利条件.1 材料与方法1.1 材料 1.1.1 菌种分离源市售青菜头、大白菜、卷心菜、萝卜、冬瓜,实验室腌制. 1.1.2 培养基培养基1:蛋白胨10g ;牛肉膏10g ;琼脂15g ;酵母提取物5g ;柠檬酸二铵2g ;葡萄糖20g ;碳酸钙20g ;吐温80 1ml ;K 2HPO 42g ;MgSO 4·7H 2O 0.58g ;MnSO 4·4H 2O 0.25g ;蒸馏水1000ml ;pH6.4,用于乳酸菌的分离与鉴定3.培养基2:液体MRS 培养基:蛋白胨10g ;酵第3期刘璞等:新型发酵蔬菜制品乳酸菌发酵剂的筛选研究

5、 317母提取物5g;柠檬酸二铵2g;葡萄糖20g;牛肉膏10g;吐温80 1ml;K2HPO42g;MgSO4·7H2O 0.58g;MnSO4·4H2O 0.25g;蒸馏水1000ml; pH6.4,用于乳酸菌的活化及筛选.培养基3(蔬菜汁基础培养基:番茄原汁30ml,加蒸馏水至100ml,蛋白胨1%,葡萄糖2%,pH6.8,用于乳酸菌的增殖培养4.1.2仪器与设备SPX型智能生化培养箱,宁波江南仪器厂; XLZ-107E显微镜;722光栅分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;pHS-25数显pH计,上海精密科学仪器有限公司;电热手提式压力蒸汽消毒器,宁波医疗器械厂;电

6、热鼓风干燥箱,重庆银河试验仪器有限公司;Acculab ALC210.3电子天平, Acsulab公司.1.3方法1.3.1 乳酸菌的分离、鉴定取各样品不同阶段发酵液进行梯度稀释,倾注平板于37培养48h,挑取单个有溶钙圈菌落纯化,根据菌落特征进行初步归类,对革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株,进一步进行纸层析实验5,所确定乳酸菌菌株,编号,保存.1.3.2 菌株发酵性能测试将各菌种分别转管活化数次,恢复活力,在250ml三角瓶中装入100ml初始pH为6.4的MRS 液体培养基,然后再向此培养基中分别接种已活化的各菌种,接种量为2%,于37条件下培养24h,每隔3h取菌液,滴定酸度和pH

7、值,并以培养时间为横坐标,以相应的OD值、酸度和pH值为纵坐标,绘制曲线,初步选定产酸力强、生长稳定的菌株为发酵实验菌.1.3.3 发酵剂的优选混合配比实验:对所筛选的发酵菌种以液体MRS培养基为基础进行混合配比实验,以细胞浓度(OD值和pH为考察指标,绘制混合菌株OD值和pH随时间变化曲线,得出发酵剂的菌株的组成及最适配比.初步发酵实验:选择新鲜、大小适中的青菜头经清洗、修剪,入坛压实,加入8%的无菌盐水,从以上实验中筛选的发酵剂进行接种(接种量2%,作为接种发酵组;相同条件下不接种,作为自然发酵组;于室温(25发酵,菜水盐度平衡时为发酵成熟,进行感观评定,判断腌制榨菜的风味品质.1.3.4

8、 分析方法细胞浓度测定(光密度法:用722分光光度计在波长600nm处测定培养液的光密度6.pH值测定:用pHS-25数显pH计直接测定.产酸率:以酚酞为指示剂,用0.1N的氢氧化钠溶液滴定,结果以乳酸百分含量表示:乳酸(% =(N NaOH V NaOH×0.09/V样品×1007.感观评定8:感观评定人员为10人,均为学表1 分离菌株形态特征菌落形态菌体形态编号大小/mm 颜色表面大小/m 菌体形态,排列染色结果来源Lact.1 0.2-0.7 乳白光滑 0.5-0.8 球形或卵圆形,一般成对G+青菜头Lact.2 0.5-2 灰白湿润光滑 0.5-1 球棒状,单个、成

9、对或成链G+大白菜Lact.3 <1 灰白湿润光滑 0.8-1×1-2球杆状,单个或成对G+大白菜Lact.4 0.2-1 灰白湿润光滑 0.6-1 球形或球杆状,单个或成对G+卷心菜Lact.51-2乳白光滑 0.6-1 球形,一般成对,有时短链G+卷心菜Lact.6 0.5-1 灰白表面发暗 0.5×1 球杆状,单个或成对G+萝卜Lact.7 0.1-0.2 灰白表面发暗 0.5×1-2 短杆状,成对或成链G+萝卜Lact.8 0.5-1.5 乳白光滑 0.5×0.8-1 短杆桩,一般成对G+冬瓜318 宁波大学学报(理工版 2006习过食品感

10、观评定的师生. 取榨菜样品,切片后,摊开,分别对色泽、形态、风味和质地进行评定,根据标准进行打分,评分标准为:色泽及形态30分,香气30分,质地40分.2 结果与讨论2.1 菌种分离、鉴定从5种腌制原料中初步分离出菌株15株,经革兰氏及芽孢染色镜检、接触酶反应,筛选出8株革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株,经乳酸纸层析定性分析均为乳酸菌菌株. 其形态学特征见表1.2.2 菌株发酵性能测试 2.2.1 菌株生长曲线通过测定各菌株发酵培养过程中培养液的OD 值变化,依据菌株各自的生长趋势,分析比较菌株的生长量和生长速度. 由图1菌株24h 的OD 值变化,可以看出,Lact .8、Lact .

11、1菌株生长快,菌体密度大,生长也较稳定,14h 左右进入平稳期,生长周期相对较长. 其次,Lact .6相对生长较快,菌体密度较大,生长比较稳定,约12h 进入平稳期;而Lact .2生长周期相对较短,菌体密度较小,在10h 左右进入平稳期,生长稳定;其他菌株则均在14h 左右进入平稳期,生长状况稳定. 2.2.2 菌株pH 及酸度变化曲线菌株培养液的酸度及pH 变化情况,可以直观地反映出各菌株的产酸速度和产酸量大小. 由图2及图3可知,各菌株产酸曲线随时间变化均呈上升趋势,产酸量不断增加,在生长过程中,乳酸菌快速繁殖产酸,使发酵液的pH 值迅速下降,从而可抑制其他有害微生物的活动,其中Lac

12、t .8产酸量最高,产酸速度快,其次是Lact .6,产酸速度较快,它们可以在发酵初期就占优势,使pH 迅速下降;而Lact .2虽产酸量较低,但是可以防止产品后期过酸,促进戊糖发酵,对产品后熟风味有利3. 因此,分别选择Lact .8、Lact .6与Lact .2菌株作为发酵剂的菌株组成,在抑制杂菌同时,又可增加制品风味. 2.3 混合菌株发酵配比的确定以发酵温度为37,接种量2%,发酵液体MRS 培养基,Lact .2与Lact .6、Lact .2与Lact .8种间比为0:1,1:0,1:1,1:2,2:1,pH 值和OD 值随时间变化曲线如图4-7所示.由图4、5可知,在相同培养条

13、件下,2菌株共同培养后,菌体密度和产酸量都比任何菌种单独培养要高,尤其,在相同培养条件下,当菌种之间的配比为1:2时,发酵初期,其产酸和OD 值很明显都比其他配比要高,这说明这2种菌共同培养并无拮抗效应,而是利用混合菌种在培养过程中的互生作用,使之能更加充分地利用现有的碳源和氮源,使乳酸积累量增高,促进菌株生长代谢3. 实验结果表明,Lact .2与Lact .6的2种菌组合生产发酵剂要优于单一菌种,最佳配比为1:2.从图6和图7可以看出,发酵初期,约从发酵 图1 OD 值随培养时间变化曲线 图2 pH 值随培养时间变化曲线 图3 发酵过程酸度变化曲线 第3期 刘 璞等:新型发酵蔬菜制品乳酸菌

14、发酵剂的筛选研究 319开始到8h ,混合配比发酵产酸速度、产酸量均有优势,可以迅速使环境pH 下降,抑制杂菌生长,而且后期不致使酸度过酸,采用混合菌种发酵,尤其是同型发酵菌与异型发酵菌混合发酵,可使产品风味更突出9. 经多次实验验证,结果一致,均显示出以1:1与2:1效果较好,其中1:1比2:1略有优势,最后选择1:1为最佳菌株配比. 表2 腌制榨菜风味比较试验组 感观评分主要风味特点 自然发酵 82 微黄色,有明显发酵香味,脆,酸咸适中 Lact .280 黄色,香味较淡,较软,偏咸Lact .677 黄色,香气不足,较脆,偏酸Lact .8 79 黄色,香气不足,较脆,偏酸Lact .2

15、: Lact .8(1:185 微黄色,发酵香味浓郁,脆嫩,酸咸适中 Lact .2: Lact .6(1:283微黄色,有发酵香气,脆,酸咸适中2.4 榨菜发酵试验通过上述试验得到的2组较优配比Lact .2: Lact .6(1:2和Lact .2:Lact .8(1:1,进一步以榨菜为发酵基质,进行接种发酵试验和产品感观评定比较,并以单菌种为发酵对照,见表2. 试验结果表明,单菌种发酵风味不及混合菌种发酵,混合发酵剂发酵后榨菜产品在风味和脆感上与自然发酵质量相 图4 Lact .2与Lact .6混合发酵OD 值变化图5 Lact .2与Lact .6混合发酵pH 值变化 图6 Lact

16、 .2与Lact .8混合培养OD 值曲线图7 Lact .2与Lact .8混合发酵pH 值变化 320 宁波大学学报(理工版 2006当,质量更稳定,其中Lact.2:Lact.8(1:1组合发酵感观评定略优于Lact.2:Lact.6(1:2组合,故最后选择Lact.2:Lact.8=1:1作为发酵剂.3结论(1从榨菜等腌制原料中分离出8株乳酸菌菌株,从产酸及发酵风味角度分析,确定了Lact.8、Lact.6和Lact.2为混合发酵用菌株.(2由Lact.6或Lact.8与Lact.2的混合配比实验,通过产酸及生长性能比较,得出最佳发酵剂菌株配比为Lact.2:Lact.6(1:2和La

17、ct.2:Lact.8(1:1.(3由混合菌株发酵剂通过榨菜腌制和感观评定结果,两者风味与自然发酵气味和脆感相当,质量更稳定,经综合比较,最后选择Lact.2:Lact.8(1:1为榨菜发酵腌制用发酵剂.参考文献:1陈有容, 杨凤琼. 降低腌制蔬菜亚硝酸盐含量方法的研究进展J. 上海水产大学学报, 2004, 13(1:67-70. 2吴祖芳, 刘璞, 翁佩芳. 榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展J. 食品与发酵工业, 2005, 31(8:73-76. 3赵玲艳, 邓放明, 杨抚林. 自然发酵辣椒中优良乳酸菌的分离与鉴定J. 食品研究与开发, 2004, 25(3:105- 108.4贺稚

18、非, 向瑞玺, 李洪军, 等. 橄榄菜直投式乳酸菌发酵剂的研究J. 四川食品与发酵, 2005(1:1-6.5周德庆. 微生物学实验手册M. 上海: 上海科学技术出版社, 1986.6曹方, 何连芳, 刘茵. 乳酸菌在腌制酸菜中最适发酵条件的研究J. 中国调味品, 2003(6:26-30.7杨晓晖, 籍保平, 李博, 等. 泡菜中优良乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能的研究J. 食品科学, 2005, 26(50: 130-134.8黄业传, 曾凡坤. 榨菜叶酸菜发酵剂的选择J. 食品与机械, 2004, 20(1:5-7.9沈国华, 卢英, 何丁喜, 等. 纯菌接种发酵技术在腌渍蔬菜加工上的应用

19、研究(二纯菌接种发酵技术最佳发酵模式的确定与应用J. 中国调味品, 2002(6:24- 36.Screening Lactic Acid Bacteria Starter for New Type of Fermented Vegetable ProductsLIU Pu, WENG Pei-fang, WU Zu-fang(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, ChinaAbstract:Some strands of lactic acid bacteria were obtained by separating from some natural pickled vegetable products, such as pickled mustard tuber, etc. From observing cell char