实验1 试剂盒方法提取基因组DNA组和质粒DNA

1、黄华如（生命科学学院，生技091，29号）摘要：实验用试剂盒方法提取nchpzh008植物DNA组，本组可以在电泳图谱中清晰看到DNA条带，而在用不同引物组合来对DNA进行PCR，在聚丙烯凝胶电泳图谱中可以看到，引物组合me4em3、me5em2、me5em3对植物DNA使比较好的，这些引物组合可以用在不同物种的遗传特性分析。利用柱式试剂盒提取PUC18和500bp质粒DNA，其中1-3组提取PUC18，4-6组提取500bp质粒DNA。结果是提取PUC18质粒DNA的同学没能将质粒提取出来，而提取500bp的全部都可以提出来。说明了PUC18质粒没有成功转化大肠杆菌，而500bp则转进了大肠

2、杆菌。 关键词：试剂盒；DNA基因组；PCR技术；质粒DNA植物细胞通常有三套基因组，即染色体基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组，其对应的DNA分别称为基因组DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。植物细胞的总DNA中95%以上是基因组DNA，而且在常规提取条件下，mtDNA和ctDNA因裸露存在，没有蛋白质的保护，会由于提取缓冲液中酸、碱的水解而丢失。质粒是存在于细菌细胞中的染色体外小分子DNA，一般呈双链闭合环状，能自我复制和垂直遗传，并赋予宿主细胞一些新表性，但质粒的存在对细胞本身的存在并不是必需的。质粒本身或经过一定改造后的质粒常被用作基因载体，将外源基因带入受体细胞中复制和扩增，甚至表达

3、。质粒有严谨型和松弛型之分，基因工程研究中所用的质粒主要是松弛型质粒，或是经过遗传修饰的人工质粒。DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下，不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与

4、DNA会结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低，质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。用试剂盒方法提取DNA组是一种比较方便和高效的方法。1 材料与方法1.1 试供材料 nchpfszh004、nchpfzh01101、nchpfzh01102、农场和平1号、nchpzh021、nchpzh008、大肠杆菌1.2 试剂配制氯仿、异丙醇、Tris、Hcl、EDTA、75%乙醇、灭菌水、TBE缓冲液、硼酸、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、琼脂糖等实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移

5、液枪、PH计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。1.4 试剂盒方法提取DNA组步骤1) 65预热柱式植物DNAout溶液A，使其沉淀融化，充分混匀，取加入到5ml朔料离心管中并放置65待用；2) 称取植物组织，液氮研磨后加入到5ml离心管中；3) 将匀浆物全部转移到新的离心管中；4) 在匀浆液中加入倍体积预热的溶液B到离心管中，颠倒数次混匀，此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生；5) 65水浴4min，如果室温放置，DNA产量会降低1020%；6) 加入200ul自备氯仿，震荡混匀20s，此时溶液呈乳白色；7) 12000rpm室温离心2min，吸取上清液到一个新的离心管

6、中；8) 加入倍体积的溶液C，颠倒数次后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少2min；9) 将通用洗柱液加入离心柱中，12000rpm室温离心1min，弃穿透液；10) 重复上述操作一次；11) 空甩半分钟去除残留液体，将离心吸附柱转移到新的离心管中；12) 将离心吸附柱放置在一新的管中，加50ul通用洗脱液，室温放置5min；13) 12000rpm室温离心1min，即得植物DNA溶液；14) 由于本产品使用的离心吸附柱吸附DNA的能力较强，可以重复上步操作一次，以洗脱得到更多的DNA；15) 直接取用510ul电泳检测DNA，其余放冰箱待用。1.5 柱式试剂盒方法提取质粒DNA步骤1) 先

7、将全部RNase A溶液全部加入到溶液A中，摇匀后再取用，未用完的溶液A最好在4保存。2) 从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37振荡培养12-16小时（摇床转速200-300）。注意：建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使浓度过高，超过纯化系统处理能力二降低DNA质量。另外，延长培养时间有利于提高质量DNA浓度，但是菌液培养过长时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。3) 用1.5mL离心管收集1-4mL过夜培养饱和菌液，室温12，000rpm离心1分钟，弃上清，在短暂离心，吸弃残留液体。4) 加入250uL溶液A，用枪头充分吹打使菌体重悬（此步在冰上操作效果更佳）。注

8、意：细胞未充分悬浮会影响后续操作，可以使用悬锅振荡器帮助混匀或使用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀。5) 加入250mL溶液B(如果溶液B有沉淀，用前须37加热溶解后冷却到室温方可使用)，温和反复颠倒混匀4-6次，看到溶液变粘即可，然后冰上放置不超过4-5分钟。注意：次步处理不能超过5分钟，否则DNA的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈震荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH，降低其效率。6) 加入350mL冰上预冷的溶液C，反复颠倒混匀4-6次，可见白色沉淀物产生，然后冰上放置至少5分钟。7) 最高速（12,000rpm以上）4离心5分钟，小心将

9、上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。如果此步的离心在室温进行，更容易出现沉淀漂浮的现象。8) 静置2分钟以上让质粒DNA与吸附柱充分结合，此步十分重要。9) 室温12，000rpm离心1分钟，弃管中的废液。10) 加入500mL的通用洗柱液，室温12，000rpm离心1分钟，弃管中的废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否者乙醇会挥发。11) 重复上步1次。12) 室温12，000rpm离心1分钟，甩干残留液。此步不能省略，否者残留乙醇会影响DNA的后续使用（如DNA上样时不能沉淀到加样孔中）。13) 将离

10、心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管中，加入30-100uL65-80预热的DNA洗脱液2.0，室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液2.0也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。14) 室温12，000rpm离心1分钟，离心管底溶液即质粒DNA。15) 由于天泽基因的吸附柱结合DNA能力较强，如果再加适量DNA洗脱液2.0到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多质粒DNA（相当第一次洗脱的20-30），但注意不要使用上部得到的DNA洗脱液2.0来洗脱。2 结果分析2.1 试剂盒提取DNA电泳图谱(M：maker2000；1-4：本组提取植物DNA)图1 试剂盒提取DNA电泳图谱在图1试剂盒提取DNA电

11、泳图谱中，其中白色方框内的四条电泳带是我们1班6组的结果，四条带相对清晰，与旁边Maker亮度相比较，可以粗略推算出样品中DNA含量约为75ug/5ul，其中第三条带的亮度相对暗些，含量比75ug/5ul少。另外第四条带有出现拖尾现象，说明在提取过程中，杂质没有清除干净，还停留在样品的DNA中。对照另外组的结果，可以发现，有些组的条带比较模糊，有些甚至没有亮带，造成这样的结果除了DNA没有提出来外，还有一个原因可能是DNA中的乙醇没有完全清理掉，在点样的时候出现了“飘”现象，DNA样品溶解在电泳缓冲液中。2.2 柱式试剂盒提取质粒DNA电泳图谱（M1：maker5000；M2：maker200

12、0；1-3：本组质粒DNA）图2 质粒DNA电泳图谱 图2中，白色方框内是1班6组的实验结果，我们是用柱式试剂盒来提取500bp的大肠杆菌，从图谱中可以清晰的看到比较亮的条带。对照旁边的两条maker，可以粗略的计算出质粒DNA的含量是15ng/5ul，DNA含量相对高，说明500bp片段的目的基因已经成功转进大肠杆菌中；另外班内的1-3组的同学是用PUC18的大肠杆菌，提完电泳后，在电泳图谱中是完全没有看到亮带的，说明了PUC18质粒的目的片段没有成功转进大肠杆菌里面。3 讨论与分析3.1 提取植物DNA含量少的原因这次提取植物DNA的实验中，我们所提取的DNA质量算是不错，条带清晰，拖尾现

13、象较少，但有些组的结果不是那么理想，条带模糊，还出现拖尾现象。在电泳图谱中，条带模糊，而且其他亮带比较多，出现这些情况都是实验不成功的体现，经过讨论，造成这样的原因可能有如下：1) 实验材料不佳或者实验材料过少，应该采用新鲜柔嫩的植物材料；2) 破壁或者裂解不充分，在研磨的时候没有在低温下研磨，在加液氮的时候没有及时，造成DNA在高温中讲解，应该充分研磨，裂解充足，保持低温环境下进行研磨；3) 试剂盒的一些试剂要预热，没有预热，效果可能不太理想；4) 加完试剂后要进行震动，可能有些同学在振动得太过激烈，造成DNA断裂，使得DNA的含量降低，应该避免过激振动，防止DNA断裂；5) 在离心后提取上

14、清液的时候，有些同学贪多，取上清液中含有少量沉淀物，造成带进了杂质，这些杂质在后面的步骤是很难再除掉，造成带有蛋白质或多糖；6) 提取DNA所用的一仪器和试剂没有经过高温灭菌，烤干，造成了DNA酶带进了试剂中，将DNA分解，造成DNA量减少；7) 在吸取上清液的时候有些同学用小枪头来吸，由于小枪头的口比较小，在吸取的过程中会造成DNA断裂，使得DNA含量减少，我们应该用粗大的枪头来吸取，并且在吸取的过程中避免用力，也避免用力摇动；8) 在除掉蛋白质和色素的这一步，很多同学用的离心转速都达到了12000转，使得DNA也被沉淀了下来，造成上清液中DNA含量减少；9) 在最后一步用乙醇冲洗的时候，有些同学将DNA给冲洗掉了，造成DNA量减少，在冲洗的过程中，如果DNA有漂浮，应该离心后再倒掉乙醇；10) 有些同学在点样的时候出现了“飘”的现象，这是因为在最后一步，没有等乙醇晾干就加TE保存了，应该让乙醇充分晾干再保存11) DNA保存后应该尽快拿进冰箱保存，不要再外面放太久。3.