酵母双杂交技术

1、酵母双杂交系统1原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域 (domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子 GAL4 ，在 N 端有一个由 147 个氨基酸组成的 DNA 结合域 (DNA binding domain,BD) ，C 端有一个由 113 个氨基酸组成的转录激活域 (transcription activation domain,AD)。 GAL4 分子的 DNA 结合域可以和上游激活序列 (upstream activating sequence，UAS) 结合，而转录激活域

2、则能激活 UAS 下游的基因进行转录。但是，单独的 DNA 结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活 UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。2试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4 的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:21、视已知蛋白的 cDNA 序列为诱饵 (bait) ，将其与 DNA 结合域融合，构建成诱饵质粒。22、将待筛选蛋白的cDNA 序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。23、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。24、酵母细胞中，已分离的 DNA 结合域和转

3、录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用 4 种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。3特点优点蛋白 -蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。缺点尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。 2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳

4、性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。 3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。使用酵母双杂交技术应注意的问题真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备，并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别精选文档于其他实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。特别应提出的是，一个

5、阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。另外，若从公司购得待筛选的酵母 cDNA 文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的产品不断更新换代，要认真阅读实验指导手册，以防出现失误。4应用研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。相信随着分子生物学技术的发展与推广，酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。酵母双杂交系统操作方法LexA 酵母双杂交系统简介一、 LexA 酵母双杂交系统的设计原理报告质粒 p8op-LacZ 的 GAL4 UAS 编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA 融合激活剂

6、的情况下，报告基因 LacZ 的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48 菌株中，也可以被整合到EGY48 基因组 DNA 上。质粒 pLexA 的筛选标志为HIS3 ，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202 个氨基酸残基组成的 LexA 蛋白 ) 与目标蛋白 (钓饵， Bait) 的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1 的调控，选择与报告基因的操纵子LexA ×8 结合。质粒 pB42AD 的筛选标志为 TRP1 ，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I 与 Xho I) 上游，含有 SV40 核定位 (SV40

7、 nuclear localization)、 HA( 血凝素 ) 及 AD( 来自于 E.coli 的 88个氨基酸残基组成的 B42蛋白 ) 等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母 EGY48 的基因组中还整合有另一个报告基因Leu ，它与 LacZ 报告基因具有相同的操纵子 -LexA ，但两者启动子不同。根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD 和 AD 的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、 Y 的编码序列插入pLexA 质粒载体和 pB42AD 质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与 Y

8、能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白 X、 Y 是否具有相互作用以及作用的强弱。如果将蛋白 Y 换为取自组织或血液的cDNA 文库，则可用 X 从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA 。2精选文档二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒： pLexA 、 pB42AD 、p8op-LacZ 、 pB42AD-DNA 文库2. 酵母菌株： EGY48、 EGY48（ p8op-LacZ ）、 YM4271 （ EGY48 的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株： E.coli KC8 株4. 对照质粒：质粒用途pLe

9、xA-53 ，pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA 测序引物及pB42AD 测序引物。三、酵母双杂交实验的基本流程1. 将报告基因p8op-LacZ 转化酵母EGY48 菌株，用培养基SD/-Ura 筛选。2. 同时构建或扩增 DNA 文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3. 构建 DNA-BD/ 靶蛋白质粒 pLexA-X ，作为钓饵 (bait) 。4. 将上述钓饵质粒 pLexA-X 转化 EGY48(p8op-LacZ) 细胞株，用 SD/-His/-Ura 筛选；并用固体诱导培养基 SD/Gal/Raf/-His/-Ura 检测此 DNA-BD/ 靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。转化质粒选择培养基克隆生长情况说 明( 含有 Gal/Raf)pLexA-Pos SD/-His ， -Ura 蓝 阳性对照pLexA SD/-His ， -Ura 白 阴性对照PlexA-X SD/-His ， -Ura 白 没有直接激活活性PlexA-X SD/-His ， -Ura 蓝 具有直接激活活性PlexA-X SD/-His ，