《酯酶与氧化酶》ppt课件

1、一、根本概念一、根本概念1. 定义：定义：酯酶酯酶(Esterase), 催化作用于酯类物质的催化作用于酯类物质的酯健酯健,使之水解的酶的总称使之水解的酶的总称,包括磷酸酶包括磷酸酶, 羧羧酸酯水解酶酸酯水解酶, 硫酸酯水解酶等。硫酸酯水解酶等。羧酸酯水解酶羧酸酯水解酶(Carboxylic ester hydrolase)，是一切能催化羧酸酯水解的酶的总称或是一切能催化羧酸酯水解的酶的总称或称酯酶，其作用是水解脂肪族酯和芳香称酯酶，其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反响式：族酯，催化的反响式：RCOOR,+ H2ORCOOH +R,OH水解酶酯化酯脂肪酸醇羧酸2. 2. 酯和酯键酯和酯键

2、酯由来自羧酸的酰基和来自醇的烃氧基组成，酯由来自羧酸的酰基和来自醇的烃氧基组成，是羧酸与醇反响失水而生成，即羧基上羟基是羧酸与醇反响失水而生成，即羧基上羟基和醇羟基上的氢共同脱水。通式和醇羟基上的氢共同脱水。通式R-CO-ORR-CO-OR，构造上可看作羧酸中的羟基被烃氧基构造上可看作羧酸中的羟基被烃氧基-OR-OR取代的产物，亦可看作醇中羟基的氢原子被取代的产物，亦可看作醇中羟基的氢原子被酰基酰基R-CO-R-CO-取代的产物。取代的产物。RCOOR,+ H2ORCOOH +R,OH水解酶酯化酯脂肪酸醇羧酸酰基酰基R-CO-R-CO-是含氧酸分子是含氧酸分子RCOOHRCOOH中去掉酸性中去

3、掉酸性OHOH后即能离解出后即能离解出H+H+的的OHOH基余下的基团。包括丙基余下的基团。包括丙酰基酰基( (丙酸、苯甲酰基苯甲酸、草酰基草丙酸、苯甲酰基苯甲酸、草酰基草酸、苯磺酰基苯磺酸、亚硝酰基亚硝酸、酸、苯磺酰基苯磺酸、亚硝酰基亚硝酸、亚硫酰基亚硫酸、磷酰基磷酸。亚硫酰基亚硫酸、磷酰基磷酸。COOR1酯键酰基烃氧基RA RCOOA R1酯键酰基烃氧基 3. 3. 酯酶与水解反响酯酶与水解反响 羧酸酯酶水解羧酸酯为醇和羧酸羧酸酯酶水解羧酸酯为醇和羧酸芳香酯酶水解乙酸苯酯为酚和乙酸芳香酯酶水解乙酸苯酯为酚和乙酸脂肪酶水解甘油三酯为甘油二酯和脂肪酸脂肪酶水解甘油三酯为甘油二酯和脂肪酸乙酰酯酶

4、水解乙酰酯为醇和乙酸乙酰酯酶水解乙酰酯为醇和乙酸乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸胆碱酯酶水解酯酰胆碱为胆碱和羧酸胆碱酯酶水解酯酰胆碱为胆碱和羧酸 根据酶对底物、根据酶对底物、pH、激活剂、抑制剂的反响特、激活剂、抑制剂的反响特点，可将酯酶分为点，可将酯酶分为20余种，在生物化学上统称为酯酶，余种，在生物化学上统称为酯酶，只需一部分可用组化的方法证明。通常根据对底物能只需一部分可用组化的方法证明。通常根据对底物能否具有特异性，可分为特异性与非特异性酯酶两种。否具有特异性，可分为特异性与非特异性酯酶两种。分解短链分解短链C2C4低级脂肪酸酯多为非特异性酯低级

5、脂肪酸酯多为非特异性酯酶，如芳香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特异性酯酶，如芳香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特异性酯酶据其底物特异性可分为，分解长链酶据其底物特异性可分为，分解长链(C8以上高级以上高级脂肪酸酯的酶称酯酶脂肪酸酯的酶称酯酶(Lipase)，分解乙酰胆碱的乙酰，分解乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶，分解酯酰胆碱的胆碱酯酶。胆碱酯酶，分解酯酰胆碱的胆碱酯酶。二、酯酶的分类二、酯酶的分类一非特异性酯酶一非特异性酯酶(non-specific esterase)： 无底物特异性。根据无底物特异性。根据E600, DFP, PCMB对它们对它们的抑制造用不同，分为的抑制造用不同，分为3类类.1. 芳

6、香芳香基酯酶基酯酶(Aromesterase)，即，即A-酯酶，亦称有机酯酶，亦称有机磷酸抵抗性酯酶磷酸抵抗性酯酶I。底物：底物：萘酚乙酯萘酚乙酯萘酚乙酸酯类萘酚乙酸酯类吲哚酚乙酸酯类吲哚酚乙酸酯类OCOCH3OCOCH3CONHC6H5NOCOCH3H完全抑制完全抑制10mmol/L 磷酸二乙基对硝基苯酯磷酸二乙基对硝基苯酯(E 600)1mmol/L CuSO41mmol/L Pb(NO3)210mmol/L AgNO3100 mol/L 对氯高汞苯甲酸对氯高汞苯甲酸(PCMB)激活激活mmol/L半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine)、脂肪族酯酶、脂肪族酯酶aliesterase),即即B

7、-酯酶，亦称有酯酶，亦称有机磷酸敏感性酯酶机磷酸敏感性酯酶底物底物萘酚乙酯；萘酚乙酯；萘酚乙酸酯类；萘酚乙酸酯类；吲哚酚乙酸吲哚酚乙酸酯类。酯类。完全抑制完全抑制10mol/L磷酸二乙基对硝基苯酯磷酸二乙基对硝基苯酯(E-600)100mol/L毒扁豆碱毒扁豆碱(Eserine)10mmol/L AgNO3.乙酰酯酶乙酰酯酶(acetylesterase)：即：即C-酯酶，酯酶， 又称有机磷酸抵抗性酯酶又称有机磷酸抵抗性酯酶底物底物吲哚酚乙酸酯类吲哚酚乙酸酯类萘酚萘酚AS乙酸酯类乙酸酯类完全抑制完全抑制10mmol/L -苯丙酸苯丙酸10mmol/L AgNO31mmol/L CuSO4 激活

8、激活100mol/L 对氯高汞苯甲酸对氯高汞苯甲酸(PCMB)100mol/L 苯氯化汞苯氯化汞非特异性酯酶A酯酶B酯酶C酯酶别称芳香/芳基酯酶, 有机磷酸抵抗性酯酶羧酸酯酶, 芳香族酯酶, 有机磷酸敏感性酯酶乙酰酯酶, -SH抑制性抵抗性酯酶, 有机磷酸抵抗性酯酶E600 (10-4mol/L)抑制PCMB (10-4mol/L)抑制激活二特异性酯酶二特异性酯酶(Specific esterase)根据底物的特异性分为三种根据底物的特异性分为三种:、脂酶、脂酶(Lipase)底物：高级脂肪酸底物：高级脂肪酸抑制剂：毒扁豆碱抑制剂：毒扁豆碱(eserine)激活剂：激活剂：2.5%牛磺胆酸钠牛

9、磺胆酸钠、胆碱酯酶、胆碱酯酶(cholinesterase) 特异性底物：丁酰硫代胆碱特异性底物：丁酰硫代胆碱 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA) 3、乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase) 底物：乙酰底物：乙酰甲基硫代胆碱甲基硫代胆碱 乙酰硫代胆碱乙酰硫代胆碱 乙酰基吲哚重氮盐乙酰基吲哚重氮盐 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)酯酶的鉴别酯酶的鉴别、根据底物特异性、根据底物特异性选择特异底物配制孵育液选择特异底物配制孵育液、选择一定浓度的抑制剂或激活剂、选择一定浓度的抑制剂或激活剂通常

10、运用抑制剂的方法是向底物通常运用抑制剂的方法是向底物液中加抑制剂或将切片在抑制液中浸液中加抑制剂或将切片在抑制液中浸渍。渍。一显示法一显示法 A.A.偶氮色素法偶氮色素法 、反响原理、反响原理在酶作用下，从底物游离出来的在酶作用下，从底物游离出来的- -萘酚萘酚ASAS与重与重氮盐偶联构成偶氮色素，同时冷静于酶的存在部位，氮盐偶联构成偶氮色素，同时冷静于酶的存在部位，经过偶氮色素显色，间接证明酶的存在部位。经过偶氮色素显色，间接证明酶的存在部位。- -萘酚系统可用重氮盐坚牢蓝，坚牢蓝萘酚系统可用重氮盐坚牢蓝，坚牢蓝RRRR，坚牢红坚牢红RCRC盐。盐。萘酚萘酚ASAS系统用柘榴石黄色、系统用柘

11、榴石黄色、GBGB盐、坚牢红盐、坚牢红RCRC、坚牢红紫坚牢红紫LCLC盐。盐。三、非特异性酯酶三、非特异性酯酶OCOCH3CONHC6H5酯酶COOHC6H5NH+ CH3COOH萘酚AS醋酸萘酚AS乙酸COOHC6H5NH+萘酚ASNHCOCLOCH3NNCLNOCH3CLCONHNNHC6H5OHCO可林思LB盐偶氮色素2. 2. 孵育液孵育液 萘酚萘酚ASAS乙酸酯法乙酸酯法 Pearse,1972 Pearse,19721%1%萘酚萘酚ASAS醋酸盐丙酮溶液醋酸盐丙酮溶液0.1ml (0.1ml (底物底物0.05mol/L PBS(pH 7.0)0.05mol/L PBS(pH 7

12、.0) 10ml 10ml缓冲液缓冲液坚牢蓝坚牢蓝B B盐盐30mg30mg重氮盐重氮盐搅拌过滤运用搅拌过滤运用3. 3. 操作步骤操作步骤 (1) (1)新颖组织恒冷箱切片；新颖组织恒冷箱切片； (2) (2)入孵液，室温或入孵液，室温或37 20-30min37 20-30min； (3) (3)流水冲洗流水冲洗2min2min； (4)2% (4)2%甲基绿复染细胞核；甲基绿复染细胞核； (5) (5)流水冲洗流水冲洗3-5min3-5min； (6) (6)甘油明胶封固。甘油明胶封固。4. 4. 结果与评价结果与评价酶活性部位为黑色，胞核为绿色。活性部位的染酶活性部位为黑色，胞核为绿色

13、。活性部位的染色视重氮盐不同而异。坚牢红色视重氮盐不同而异。坚牢红TRTR为紫红色，坚牢红为紫红色，坚牢红RCRC为暗红色，坚牢蓝为暗红色，坚牢蓝RRRR为青铜色。为青铜色。5. 5. 组织处置阐明组织处置阐明非特异性酯酶类对固定非特异性酯酶类对固定的抵抗性较强，可用醛类固的抵抗性较强，可用醛类固定液固定后冰冻切片。定液固定后冰冻切片。10%10%福福尔马林钙、尔马林钙、4%4%多聚甲醛磷多聚甲醛磷酸缓冲液或二甲胂酸盐缓冲酸缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液，液，pH7.2-7.4; 4pH7.2-7.4; 4固定固定16-16-1818小时，时间随酶活性强弱小时，时间随酶活性强弱不同。不同。 - -醋

14、酸萘酚酯醋酸萘酚酯 萘酚萘酚ASAS乙酸酯乙酸酯 坚牢蓝坚牢蓝B B盐盐 坚牢蓝坚牢蓝BBBB盐盐B.B.偶氮吲哚酚法偶氮吲哚酚法1. 1. 反响原理反响原理在非特异性酯酶作用下，醋酸吲哚酚酯被在非特异性酯酶作用下，醋酸吲哚酚酯被水解为吲哚酚和醋酸，吲哚酚与六氮盐偶联成水解为吲哚酚和醋酸，吲哚酚与六氮盐偶联成偶氮色素。偶氮色素。NOCORH+ H2OHNOH+ RCOOH酯酶吲哚酚酯吲哚酚酯吲哚酚吲哚酚羧酸羧酸+六氮盐六氮盐 偶氮色素偶氮色素2. 2. 孵育液孵育液醋酸吲哚酚醋酸吲哚酚 3mg3mg二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺 0.3ml0.3ml六氮化副蔷薇苯胺缓冲液六氮化副蔷薇苯胺缓冲液10m

15、l10ml六氮化副蔷薇苯胺六氮化副蔷薇苯胺0.3ml0.3ml溶于溶于0.1mol/L PBS 0.1mol/L PBS pH5-6,pH5-6,用用1mol/L-0.1mol/L NaOH1mol/L-0.1mol/L NaOH将将pHpH调至调至5-5.55-5.5，混匀过滤立刻便用。混匀过滤立刻便用。3. 3. 操作步骤操作步骤(1)(1)恒冷箱切片入孵液，恒冷箱切片入孵液，3715-60min3715-60min；(2)(2)蒸馏水洗；蒸馏水洗；(3)4%(3)4%甲醛固定数小时；甲醛固定数小时；(4)(4)甘油明胶封固。甘油明胶封固。4. 4. 结果结果酶活性处呈红棕色酶活性处呈红棕

16、色腹水癌细胞中的酯酶腹水癌细胞中的酯酶巨噬细胞中的酯酶巨噬细胞中的酯酶C.吲哚酚法吲哚酚法(靛蓝法靛蓝法) Pearse, 1972 .原理原理醋酸吲哚酚经酶水解释放出吲哚酚，再氧化构成醋酸吲哚酚经酶水解释放出吲哚酚，再氧化构成靛蓝冷静于酶所在部位。靛蓝冷静于酶所在部位。NHOCOCH3+ H2O酯酶HNOH+ CH2COOHOHNH+HNOH+O2NOHCCNHO靛蓝底物底物:5-:5-溴溴-6-6-氯吲哚酚乙酸酯氯吲哚酚乙酸酯,5-,5-溴吲哚酚乙酸酯等溴吲哚酚乙酸酯等. .氧化剂氧化剂: :铁氰化钾、亚铁氰化钾铁氰化钾、亚铁氰化钾. .孵育液孵育液(1)(1)醋酸溴吲哚酚酯醋酸溴吲哚酚酯

17、2mg2mg(2)(2)二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺0.2ml0.2ml(3)(3)贮藏液贮藏液10ml10ml贮藏液配制：贮藏液配制：铁氰化钾铁氰化钾(1.65%)(1.65%)5ml5ml亚铁氰化钾亚铁氰化钾(2.11%)(2.11%)5ml5ml0.1mol/L Tris-HCL0.1mol/L Tris-HCL缓冲液缓冲液pH6.8pH6.820ml20ml2%CaCL22%CaCL210ml10ml蒸馏水蒸馏水10ml10ml3. 3. 操作步骤操作步骤新颖组织恒冷箱切片；新颖组织恒冷箱切片；切片入孵育液，切片入孵育液，3737或室温或室温 5-120min 5-120min；蒸馏水洗；

18、蒸馏水洗；甘油明胶封固。甘油明胶封固。4. 4. 结果结果酶活性部位呈青绿色，背底无色。酶活性部位呈青绿色，背底无色。. .留意留意铁氰化钾氧化吲哚酚除产生靛蓝外，还有无色产物。铁氰化钾氧化吲哚酚除产生靛蓝外，还有无色产物。因此酶活性与显色无平行关系，可定性不可定量。因此酶活性与显色无平行关系，可定性不可定量。肾间质细胞肾间质细胞 油螺卵母细胞油螺卵母细胞 底物：底物：5-5-溴吲哚酚乙酸酯溴吲哚酚乙酸酯主要定位于内质网和溶酶体，生理功能尚不清楚主要定位于内质网和溶酶体，生理功能尚不清楚, ,目前以为目前以为主要参与酯类和蛋白质代谢。主要参与酯类和蛋白质代谢。极强阳性：胰腺外分泌部腺细胞，横纹

19、肌运动终板，小肠极强阳性：胰腺外分泌部腺细胞，横纹肌运动终板，小肠 上皮细胞；上皮细胞；强阳性：肝细胞，肾近曲小管上皮，结肠上皮细胞；强阳性：肝细胞，肾近曲小管上皮，结肠上皮细胞；阳性：胰腺和腮腺导管上皮，食管上皮，肠腺上皮，肺泡阳性：胰腺和腮腺导管上皮，食管上皮，肠腺上皮，肺泡 巨噬细胞，睾丸间质细胞。巨噬细胞，睾丸间质细胞。弱阳性：心肌细胞，胰岛细胞，胆管、甲状腺、气管、支弱阳性：心肌细胞，胰岛细胞，胆管、甲状腺、气管、支 气管、膀胱等上皮细胞。气管、膀胱等上皮细胞。二非特异性酯酶的生物学意义二非特异性酯酶的生物学意义特异性酯酶脂酶乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶底物高级脂肪酸乙酰胆碱，乙酰-基甲基胆

20、碱乙酰胆碱，苯甲酰胆碱，长链脂肪酸胆碱抑制剂毒扁豆碱异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)四异丙基氨基焦酰胺激活剂2.5%牛磺胆酸钠广义的胆碱酯酶包括乙酰胆碱酯酶广义的胆碱酯酶包括乙酰胆碱酯酶AChE)和狭义的胆碱和狭义的胆碱酯酶酯酶(ChE)，两者化学性质不同，用酯来检测底物特异性时，乙，两者化学性质不同，用酯来检测底物特异性时，乙酰胆碱酯酶能最快地促使乙酰胆碱分解，也能水解乙酰酰胆碱酯酶能最快地促使乙酰胆碱分解，也能水解乙酰-基甲基甲基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此酶能被高浓度的乙酰胆碱基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此酶能被高浓度的乙酰胆碱抑制。但胆碱酯酶却不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被胆碱

21、酯抑制。但胆碱酯酶却不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被胆碱酯酶所分解。酶所分解。ChE还能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙酰还能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙酰-基甲基甲基胆碱。基胆碱。乙酰胆碱乙酰胆碱+H2O +H2O 胆碱胆碱+ +醋酸醋酸酯酰胆碱酯酰胆碱+H2O +H2O 胆碱胆碱+ +羧酸羧酸AChEChE四、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶四、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶(Acetylcholinesterase and Cholinestrase, AChE and ChE)乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶乙酰胆碱快高浓度时抑制其活性高浓度不抑制其活性乙酰-基甲基胆碱苯甲酰胆碱快长链脂肪酸胆碱快AChE 和和 ChE的

22、底物特异性的底物特异性一显示方法一显示方法亚铁氰化铜法亚铁氰化铜法1 1、反响原理、反响原理利用乙酰胆碱酯酶能将乙酰胆碱盐水解产生硫利用乙酰胆碱酯酶能将乙酰胆碱盐水解产生硫代胆碱，使铁氰化物复原为亚铁氰化物，再与铜离代胆碱，使铁氰化物复原为亚铁氰化物，再与铜离子结合构成亚铁氰化铜显色沉淀，证明酶活性的存子结合构成亚铁氰化铜显色沉淀，证明酶活性的存在。在。乙酰胆碱盐乙酰胆碱盐AChE硫代胆碱硫代胆碱假设用四异丙基焦磷酰胺抑制胆碱酯酶，可单独假设用四异丙基焦磷酰胺抑制胆碱酯酶，可单独显示乙酰胆碱酯酶。显示乙酰胆碱酯酶。铁氰化钾铁氰化钾亚铁氰化钾亚铁氰化钾+Cu2+亚铁氰化铜亚铁氰化铜、孵育液、孵育

23、液乙酰硫代胆碱碘盐乙酰硫代胆碱碘盐5mg5mg0.1mol/L0.1mol/L醋酸缓冲液醋酸缓冲液pH5.5pH5.56.5ml6.5ml0.1mol/L (2.94%) 0.1mol/L (2.94%) 柠檬酸钠柠檬酸钠0.5ml0.5ml30mmol/L (0.75%) CuSO430mmol/L (0.75%) CuSO41.0ml1.0ml5mmol/L (0.164%) 5mmol/L (0.164%) 铁氰化钾铁氰化钾1.0ml1.0ml 蒸馏水蒸馏水1.0ml1.0ml乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次参乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次参与其它溶液，临用前不超越与其

24、它溶液，临用前不超越3030分钟内配制，充分混匀，分钟内配制，充分混匀，至溶液呈亮绿色，最终至溶液呈亮绿色，最终pH5.5pH5.5。、操作步骤、操作步骤(1) (1) 新颖组织恒冷箱切片；新颖组织恒冷箱切片；(2)(2)冷丙酮或冷丙酮或10%10%福尔马林固定福尔马林固定20-25min20-25min；(3)(3)蒸馏水洗；蒸馏水洗；(4)(4)入孵育液入孵育液3737，h h；(5)(5)蒸馏水洗；蒸馏水洗；(6)(6)甘油明胶封固。甘油明胶封固。、结果与评价、结果与评价乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显棕色沉淀。乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显棕色沉淀。Cu2+Cu2+浓度太小易弥散，浓

25、度太小易弥散，pH5-5.5pH5-5.5，高于易分散。，高于易分散。、对照、对照用四异丙基焦磷酰胺用四异丙基焦磷酰胺4mM(0.%) 0.2ml4mM(0.%) 0.2ml抑制胆碱酯抑制胆碱酯酶显示乙酰胆碱酯酶；酶显示乙酰胆碱酯酶；用毒扁豆碱硫酸酯用毒扁豆碱硫酸酯3 310-5M10-5M替代蒸馏水，先将切替代蒸馏水，先将切片处置片处置3030分，水洗后入孵育液，那么二种酶均被抑制分，水洗后入孵育液，那么二种酶均被抑制呈阴性。呈阴性。( (二生物学意义二生物学意义胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸。乙酰胆胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸。乙酰胆碱酯酶活性的强弱是神经细胞性质和功能的碱酯酶活性的强弱是神经细

26、胞性质和功能的重要参考目的，亦是神经系统发生过程中的重要参考目的，亦是神经系统发生过程中的神经细胞分化的一个目的，所以在形状上将神经细胞分化的一个目的，所以在形状上将乙酰胆碱酯酶的组织化学显示作为胆碱能传乙酰胆碱酯酶的组织化学显示作为胆碱能传送部位的标志。送部位的标志。 AChEAChE是生物神经传导中的一种关键性的是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传送。神经信号在生物体内的正常传送。 AChE AChE与细胞凋亡有一定的关

27、系。在细胞程度发与细胞凋亡有一定的关系。在细胞程度发现实验所用的各类细胞，正常形状没有现实验所用的各类细胞，正常形状没有AChEAChE活性反活性反响，一旦发生凋亡，都有响，一旦发生凋亡，都有AChEAChE活性反响。用其特异活性反响。用其特异的抑制剂可以抑制其活性反响。用的抑制剂可以抑制其活性反响。用RT-PCRRT-PCR方法证明方法证明了凋亡细胞有了凋亡细胞有AChEmRNAAChEmRNA的转录。参与其抑制剂石杉的转录。参与其抑制剂石杉碱可降低凋亡基因的表达。碱可降低凋亡基因的表达。乙酰胆碱酯酶主要分布于神经系统大脑皮质乙酰胆碱酯酶主要分布于神经系统大脑皮质中有中有AChEAChE阳性

28、的神经纤维，还存在于胆碱能神经元阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神经元中、神经肌肉接头处、红细胞等，而胆碱酯酶主中、神经肌肉接头处、红细胞等，而胆碱酯酶主要分布于血清、胰腺、唾液腺内。要分布于血清、胰腺、唾液腺内。五、胆碱乙酰转移酶五、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase, ChAc) 此酶不属于羧酸酯水解酶，它是乙酰此酶不属于羧酸酯水解酶，它是乙酰胆碱的合成酶。胆碱乙酰转移酶的强弱是胆碱的合成酶。胆碱乙酰转移酶的强弱是胆碱能神经生理功能的标志，因此将胆碱能神经生理功能的标志，因此将ChACChAC确以为胆碱能神经的标志酶。确以为胆碱能神经的标志酶。 一显示方法一显

29、示方法BurtBurt法法1 1、反响原理、反响原理 胆碱乙酰转移酶可把乙酰胆碱辅酶胆碱乙酰转移酶可把乙酰胆碱辅酶A A的乙酰基转的乙酰基转移到胆碱分子上移到胆碱分子上, ,合成乙酰胆碱。辅酶合成乙酰胆碱。辅酶A A被游离出来，被游离出来，辅酶辅酶A A中的中的SHSH被铅离子沉淀而显示酶的活性。被铅离子沉淀而显示酶的活性。乙酰辅酶乙酰辅酶A+A+胆碱胆碱 乙酰胆碱乙酰胆碱+ +辅酶辅酶A A Pb2+ Pb2+ 沉淀产物沉淀产物 PbS PbS 硫化铵硫化铵ChAc2 2、孵育液、孵育液25mmol/L N-2-羟基乙基哌嗪羟基乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲乙烷磺酸缓冲 液液HEPES pH

30、6.04mmol/L 胆碱胆碱48.5mg/100ml缓冲液缓冲液0.2mmol/L 乙酰胆碱辅酶乙酰胆碱辅酶A16.2mg/100ml缓冲液缓冲液18mmol/L 硝酸铅硝酸铅59.6mg/100ml缓冲液缓冲液0.1mmol/L Phospholine iodide(乙酰胆碱酯酶抑乙酰胆碱酯酶抑 制剂制剂3.8mg/100 ml缓冲液缓冲液最终最终pH值为值为6.0。3 3、操作步骤、操作步骤1固定：固定：8m厚的冰冻切片在厚的冰冻切片在10%蔗糖和蔗糖和2%戊戊二醛的二醛的25mmol/LHEPES缓冲液缓冲液pH7.0中固定中固定5min；2漂洗：用含漂洗：用含10%蔗糖的蔗糖的HEP

31、ES缓冲液洗缓冲液洗15min3；3孵育：切片入孵育液中，室温，孵育：切片入孵育液中，室温，3h；30，15-30min；4蒸馏水洗蒸馏水洗3次；次；51%硫化铵显色硫化铵显色2min；6缓冲液漂洗，甘油明胶封固。缓冲液漂洗，甘油明胶封固。 4 4、结果：酶活性部位呈黑色沉淀。、结果：酶活性部位呈黑色沉淀。5 5、对照：、对照：1 1孵育液中可除去辅酶孵育液中可除去辅酶A A；2 2孵育液中去除胆碱，反响结果为阴性。孵育液中去除胆碱，反响结果为阴性。 二生物学意义二生物学意义 ChAcChAc是胆碱能神经元的标志酶，是乙酰胆是胆碱能神经元的标志酶，是乙酰胆碱的合成酶，分布在胆碱能神经元和纤维内

32、，碱的合成酶，分布在胆碱能神经元和纤维内，其含量的多少，可阐明神经兴奋性的高低，能其含量的多少，可阐明神经兴奋性的高低，能充分反映神经的功能。是了解胆碱能神经元及充分反映神经的功能。是了解胆碱能神经元及其所支配器官的重要目的。其所支配器官的重要目的。AChEAChE是乙酰胆碱的是乙酰胆碱的水解酶，其特性没有水解酶，其特性没有ChAcChAc高，两酶相结协作察高，两酶相结协作察看目的最为理想。看目的最为理想。 六、脂酶六、脂酶(Lipase)(Lipase)脂酶又名甘油酯水解酶，能催化长链脂肪脂酶又名甘油酯水解酶，能催化长链脂肪酸甘油酯或其它醇酯水解。酸甘油酯或其它醇酯水解。激活剂：激活剂：Ca

33、2+Ca2+、Sr2+Sr2+、Mg2+Mg2+、半胱氨酸、半胱氨酸、巯基乙酸、牛磺胆酸盐。巯基乙酸、牛磺胆酸盐。一显示方法一显示方法硫化铅法吐温法之一，硫化铅法吐温法之一，Gomori,1954)Gomori,1954)、根本原理、根本原理以长链脂肪酸酯为底物，在脂酶作用下，以长链脂肪酸酯为底物，在脂酶作用下，分别出的脂肪酸可与钙构成钙皂沉淀，再用铅分别出的脂肪酸可与钙构成钙皂沉淀，再用铅置换钙，最后经硫化胺置换生成棕黑色硫化铅置换钙，最后经硫化胺置换生成棕黑色硫化铅沉淀。沉淀。吐温吐温脂酶脂酶脂肪酸脂肪酸+Ca2+钙皂钙皂铅置换钙铅置换钙硫化胺硫化胺PbS、孵育液、孵育液5%5%吐温吐温6

34、060或或8080硬脂酸酯油酸酯硬脂酸酯油酸酯2ml2ml0.2mol/L Tris0.2mol/L Tris缓冲液缓冲液(pH7.2-7.4)(pH7.2-7.4)5ml5ml10%10%氯化钙氯化钙2ml2ml蒸馏水蒸馏水40ml40ml、操作步骤、操作步骤(1)(1)恒冷箱切片；恒冷箱切片；(2)(2)入孵育液，入孵育液，37,37,小时；小时；(3)1%CaCL(3)1%CaCL液内浸洗，使钙皂不溶；液内浸洗，使钙皂不溶；(4) 1%Pb(NO3)2(4) 1%Pb(NO3)2浸浸15min15min，置换；，置换；(5)(5)流水冲洗流水冲洗5 5分；分；(6)0.5-1%(6)0.

35、5-1%硫化胺液内硫化胺液内minmin，显色；，显色；(7)(7)水洗分；水洗分；(8)(8)甘油明胶封片。甘油明胶封片。、结果与评价、结果与评价棕黑色硫化铅沉淀为脂酶活性所在部棕黑色硫化铅沉淀为脂酶活性所在部位。本法需坚持位。本法需坚持Ca2+Ca2+浓度，才有利于在浓度，才有利于在Pb(NO3)2Pb(NO3)2液内进展充分置换反响。孵化时液内进展充分置换反响。孵化时间过长，易弥散。间过长，易弥散。、对照、对照去出吐温去出吐温6060底物为阴性底物为阴性二生物学意义二生物学意义 脂酶在体内主要催化甘油三酯水解，使之成为脂酶在体内主要催化甘油三酯水解，使之成为二酰甘油和脂肪酸，甘油三酯必需

36、在脂酶将它分二酰甘油和脂肪酸，甘油三酯必需在脂酶将它分解成甘油和脂肪酸后，才干被肠道吸收。脂肪细解成甘油和脂肪酸后，才干被肠道吸收。脂肪细胞也需求脂酶水解脂肪，以保证脂肪的外运。胞也需求脂酶水解脂肪，以保证脂肪的外运。 脂酶的定位和组织分布：脂酶主要存在于胞脂酶的定位和组织分布：脂酶主要存在于胞质的基质，高尔基复合体和线粒体也可出现阳性质的基质，高尔基复合体和线粒体也可出现阳性反响。胰腺最为丰富，其次是肝脏、肾脏、脾脏、反响。胰腺最为丰富，其次是肝脏、肾脏、脾脏、唾液腺导管但大鼠极少、胃贲门、睾丸基质唾液腺导管但大鼠极少、胃贲门、睾丸基质细胞中也存在。细胞中也存在。 一、氧化还反响一、氧化还反

37、响1. 1. 生物体内的氧化方式生物体内的氧化方式(1) (1) 脱电子反响：从底物上零落一个电子。脱电子反响：从底物上零落一个电子。Fe 2+ Fe 3+ + eFe 2+ Fe 3+ + e(2) (2) 脱氢反响：从底物上零落一对氢原子。脱氢反响：从底物上零落一对氢原子。MH2 M + 2H (2H+ + MH2 M + 2H (2H+ + 2e)2e)(3) (3) 加氧反响：向底物中直接参与氧原子加氧反响：向底物中直接参与氧原子或氧分子。或氧分子。催化上述反响的酶，称氧化复原酶。催化上述反响的酶，称氧化复原酶。受电子体、受氢体与供电子体、供氢受电子体、受氢体与供电子体、供氢体体氧化反

38、响：分解代谢中失电子、脱氢、加氧。氧化反响：分解代谢中失电子、脱氢、加氧。复原反响：合成代谢中得电子、加氢、脱氧。复原反响：合成代谢中得电子、加氢、脱氧。复原剂：供电子体复原剂：供电子体Fe2+(Fe2+(亚铁离子。亚铁离子。氧化剂：受电子体或受氢体氧化剂：受电子体或受氢体)Fe3+()Fe3+(高铁离子。高铁离子。F e2+F e3+氧化反应还原反应- e+ e根据受氢体的不同，氧化复原酶分为：根据受氢体的不同，氧化复原酶分为：氧化酶：催化氢原子直接转移到氧分子上。氧化酶：催化氢原子直接转移到氧分子上。脱氢酶：催化氢原子转移到其它受氢体上，催脱氢酶：催化氢原子转移到其它受氢体上，催化氧化过程

39、的中间环节。化氧化过程的中间环节。常见的受氢体有：常见的受氢体有：辅酶辅酶NAD+NAD+，nicotinamide adenine nicotinamide adenine dinucleotide,dinucleotide,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸；辅酶辅酶NADP+, nicotinamide adenine NADP+, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, dinucleotide phosphate, 尼克酰胺腺嘌呤尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；二核苷酸磷酸；黄素腺嘌呤二核苷酸黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD, Fl

40、avin - (FAD, Flavin - adenine dinucleotide)adenine dinucleotide)2. 2. 电子传送链电子传送链营养物质在线粒体内经三羧酸循环、脂肪营养物质在线粒体内经三羧酸循环、脂肪酸氧化等不同氧化分解途径，脱氢氧化。脱酸氧化等不同氧化分解途径，脱氢氧化。脱下的氢大多由下的氢大多由NAD+NAD+、NADP+NADP+、FADFAD接受，接受，NAD+NAD+、FADFAD是常见脱氢酶的辅酶或辅基。这些脱氢酶是常见脱氢酶的辅酶或辅基。这些脱氢酶是衔接代谢途径和电子传送链的环节。代谢是衔接代谢途径和电子传送链的环节。代谢物脱下一对氢，分别以物脱下

41、一对氢，分别以NADH + H+NADH + H+或或FADH2FADH2进进入电子传送链，最终与氧结合生成水，并释入电子传送链，最终与氧结合生成水，并释放能量。电子只能从电子亲和力低的传送体放能量。电子只能从电子亲和力低的传送体向亲和力高的传送体传送。向亲和力高的传送体传送。NADHFMN(FeS)CoQCytbCytc1CytcCytaa3O2H2ONADH CoQ还原酶CoQCytC还原酶细胞色素氧化酶电子传递链二、细胞色素氧化酶二、细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase, CCO)细胞色素细胞色素(Cytochrome, cyt)是生物细胞内一类传是生物细胞内一类传送蛋白

42、质，含有铁呋啉辅基，具有红色而取名细胞送蛋白质，含有铁呋啉辅基，具有红色而取名细胞色素。色素。电子传送链中有电子传送链中有5种不同细胞色素：种不同细胞色素：b、c、c1、a、a3， b、c、c1的辅基都含铁原呋呤血红素，铁的辅基都含铁原呋呤血红素，铁原子与呋呤环和蛋白质构成六个配位键，不能再与原子与呋呤环和蛋白质构成六个配位键，不能再与氧结合。氧结合。细胞色素是一种水溶性的膜外表蛋白，复原性细胞色素是一种水溶性的膜外表蛋白，复原性的细胞色素把它的电子传送给细胞色素氧化酶的细胞色素把它的电子传送给细胞色素氧化酶Cytaa3Cytaa3，细胞色素，细胞色素a a和和a3a3结合严密，普通分别方法结

43、合严密，普通分别方法不能将它们分开，构成一个大分子寡聚体，通常称不能将它们分开，构成一个大分子寡聚体，通常称为细胞色素为细胞色素aa3,aa3,FeFe与呋呤环和蛋白质构成五个配与呋呤环和蛋白质构成五个配位键，还保管一个配位键和位键，还保管一个配位键和O2O2、COCO和和CN-CN-氰基氰基结合，是电子传送链中能与氧进展反响的复合物，结合，是电子传送链中能与氧进展反响的复合物，能催化分子氧接受电子而被复原，称细胞色素氧化能催化分子氧接受电子而被复原，称细胞色素氧化酶或细胞色素氧化酶。酶或细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶使复原的细胞色素再氧化，是细胞色素氧化酶使复原的细胞色素再氧化，是线粒体的构

44、呵斥分之一。线粒体的构呵斥分之一。H3CCH3NNH2+OH细胞色素氧化酶NCH3H3CNO+H2O2二甲基对苯二氨靛酚蓝萘酚一显示方法一显示方法1、Nadi氧化酶反响氧化酶反响Naphthol-diamine, 萘酚二胺萘酚二胺1反响原理反响原理O22 2孵育液孵育液 N-N-苯基苯基- -对苯二胺对苯二胺 底物底物 3mg 3mg 1- 1-羟基羟基-2-2-萘酚萘酚 3mg3mg 二甲基亚砜二甲基亚砜 0.1ml0.1ml0.05mol/L0.05mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.2 10mlpH7.2 10ml混匀，过滤。混匀，过滤。3 3操作步骤：操作步骤： 1 1新颖组织，恒冷

45、箱切片；新颖组织，恒冷箱切片； 2 2入孵育液中，室温，入孵育液中，室温，2030min2030min； 3 3入入LugolLugol碘液碘液2min2min；稳定有色产物；稳定有色产物 4 4入入5%5%硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠溶液4min4min；脱碘；脱碘 5 5入入1%1%醋酸钴液中醋酸钴液中60min60min；有色产物螯合；有色产物螯合 6 6D.WD.W洗；洗； 7 7甘油明胶封固。甘油明胶封固。4 4结果：结果： 酶活性部位呈棕黑色颗粒。酶活性部位呈棕黑色颗粒。5 5对照：标本孵育于含氰化钾对照：标本孵育于含氰化钾0.0065g/10ml)0.0065g/10ml)的孵育液中

46、，呈阴性反响。的孵育液中，呈阴性反响。2. 二氨基联苯胺法二氨基联苯胺法DAB法法, diaminobenzidine1、原理、原理细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶CCO能催化能催化DAB，被，被H2O2氧化，在新颖或固定标本上生成棕色沉淀。氧化，在新颖或固定标本上生成棕色沉淀。DAB盐酸盐溶于水后无色透明，但由于盐酸盐溶于水后无色透明，但由于CCO的的作用，侧链氨基被氧化，进展反复氧化性聚合和作用，侧链氨基被氧化，进展反复氧化性聚合和氧化性环化，构成不溶性褐色吩嗪氧化性环化，构成不溶性褐色吩嗪(phenazine)聚聚合体。合体。(2) (2) 孵育液孵育液 蒸馏水蒸馏水 5ml 5ml 3,3

47、 3,3- -二氨基联苯胺二氨基联苯胺-4-4盐酸盐盐酸盐 5mg 5mg 0.2mol/L 0.2mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.4) 5mlpH7.4) 5ml 过氧化氢酶过氧化氢酶 c-100 1mg c-100 1mg 或或 c-40 4mg c-40 4mg 细胞色素细胞色素C IIIC III型型 10mg 10mg 或或 IV 5mg IV 5mg 3 3操作步骤：操作步骤： 1 1组织块浸泡固定：戊二醛固定液组织块浸泡固定：戊二醛固定液3%3%戊戊二醛，二醛，0.1mol/L PB pH7.4, 0.05%CaCl20.1mol/L PB pH7.4, 0.05%CaCl

48、2，二甲，二甲砷酸盐缓冲液，砷酸盐缓冲液，44，10min;10min; 2 2洗涤：冷固定液洗涤：冷固定液15min15min，3 3次；次； 3 3恒冷箱切片；恒冷箱切片； 4 4孵育：孵育：37 37 ，40-60min40-60min，充分洗涤；，充分洗涤； 5 5复染；复染； 6 6封片。封片。4 4结果结果 酶活性部位呈茶褐色沉淀，细胞内线粒体数酶活性部位呈茶褐色沉淀，细胞内线粒体数目多者酶活性强。目多者酶活性强。5 5 对照对照 孵育液内加孵育液内加1mM K-CN1mM K-CN或或10mM NaN310mM NaN3，反响完，反响完全呈阴性。抑制剂为氰化物、迭氮化钠全呈阴性。

49、抑制剂为氰化物、迭氮化钠NaN3NaN3、硫化氢硫化氢H2SH2S、一氧化碳，缘由是这些物质均、一氧化碳，缘由是这些物质均能与细胞色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。能与细胞色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。从反响液中去掉底物从反响液中去掉底物DABDAB不能成为对照，由于不能成为对照，由于DABDAB同时也是成色剂。同时也是成色剂。 DAB DAB将氧化型细胞色素复原，复原型细胞将氧化型细胞色素复原，复原型细胞色素又被细胞色素色素又被细胞色素a a再氧化，反复循环进展，再氧化，反复循环进展，DABDAB不断被氧化，反响氧化物沉淀堆积。不断被氧化，反响氧化物沉淀堆积。 此法从反响特异性、反复

50、性和电镜运用等此法从反响特异性、反复性和电镜运用等方面最好，用得最普遍。方面最好，用得最普遍。 DABDAB法是研讨代谢旺盛细胞线粒体的有效手法是研讨代谢旺盛细胞线粒体的有效手段。段。骨骼肌骨骼肌DAB法显示法显示CCO肾皮质肾皮质肾髓质肾髓质二生物学意义二生物学意义 几乎一切组织细胞都呈阳性反响，其强度取几乎一切组织细胞都呈阳性反响，其强度取决于细胞内的线粒体数目，是线粒体的标志酶之决于细胞内的线粒体数目，是线粒体的标志酶之一。是研讨代谢旺盛细胞线粒体的有效手段。心一。是研讨代谢旺盛细胞线粒体的有效手段。心肌、肾小管上皮、胃壁细胞、肝细胞活性均较高，肌、肾小管上皮、胃壁细胞、肝细胞活性均较高

51、，恶性肿瘤和癌前期酶活性有增高趋势。恶性肿瘤和癌前期酶活性有增高趋势。三、三、DOPA氧化酶氧化酶(Catechol Oxidase)也称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶。也称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶。1、反响原理、反响原理以以DOPA(dihydroxyphenylalanine, 二羟苯基丙氨酸为底物，氧化后经二羟苯基丙氨酸为底物，氧化后经一系列复杂反响生成黑色产物。一系列复杂反响生成黑色产物。2、 孵育液孵育液5.6mmon/L二羟苯基丙氨酸，溶于二羟苯基丙氨酸，溶于0.1mol/L磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液中，pH7.4。3. 3. 操作步骤操作步骤(1) (1) 新颖组织，厚新颖组织，厚5mm,

52、10%5mm, 10%福尔马林室温固定福尔马林室温固定1h;1h;(2) (2) 流水冲流水冲3 3分；分；(3) (3) 入孵育液，入孵育液，371h;371h;(4) (4) 换孵育液，换孵育液，3712-15h;3712-15h;(5) (5) 流水冲洗；流水冲洗；(6) Bouin(6) Bouin液固定液固定24h;24h;(7) (7) 酒精脱水，透明，石蜡包埋；酒精脱水，透明，石蜡包埋；(8) (8) 切片切片6-86-8微米，可复染；微米，可复染；(9) (9) 树胶封片。树胶封片。4. 4. 结果结果酶活性部位呈黑棕色颗粒。酶活性部位呈黑棕色颗粒。5. 5. 对照对照去底物或

53、用氰化物去底物或用氰化物6. 6. 生物学意义生物学意义对诊断恶性黑素瘤有意义。对诊断恶性黑素瘤有意义。四、单胺氧化酶四、单胺氧化酶(Monoamine Oxidase, MAO)又称肾上腺素氧化酶，酪胺酶。又称肾上腺素氧化酶，酪胺酶。1、反响原理、反响原理 MAO是催化芳香族、脂肪族单胺类氧化脱是催化芳香族、脂肪族单胺类氧化脱氨基的酶，属黄素酶，以氨基的酶，属黄素酶，以FAD为辅基。反响产为辅基。反响产物有醛和物有醛和H2O2。利用它们的复原性或氧化性。利用它们的复原性或氧化性进展组化染色。进展组化染色。E FA D+RCH2NH2+H2OEFADH2+RCHO+E FADH2+ O2EFA

54、D+H2O2NH3反响产物有醛和反响产物有醛和H2O2H2O2，利用醛的复原性和，利用醛的复原性和H2O2H2O2的氧化的氧化性进展组化染色。性进展组化染色。(1) (1) 醛复原作用醛复原作用NCH2CH2NH2EFADNH3+NCH2CHOEFADH2NCH2COOH吲哚乙胺吲哚乙醛吲哚乙酸四唑盐：NBT甲簪蓝紫颗粒氧化氧化氧化氧化复原复原(2) H2O2(2) H2O2的氧化作用的氧化作用利用产生的利用产生的H2O2H2O2经辣根过氧化物酶经辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)催化，将催化，将芳香胺氧化显色。芳香胺氧化显色。CNNNNCL+ 2HNNNNHC+HCL四唑盐（无色） +H还原

55、甲簪沉淀（蓝紫色）HRP2. 2. 孵育液孵育液四唑盐法四唑盐法盐酸色胺底物盐酸色胺底物 25mg 25mg 无水硫酸钠无水硫酸钠 4mg4mg NBT NBT四唑盐四唑盐 4mg 4mg 0.1mol/LPBS(pH7.6) 0.1mol/LPBS(pH7.6)5ml5ml 蒸馏水蒸馏水15ml15ml3. 3. 操作步骤操作步骤(1)(1)新颖冰冻切片；新颖冰冻切片；(2)(2)入孵育液，入孵育液，37 30-60min37 30-60min；(3)(3)流水冲洗流水冲洗2min2min；(4)4%(4)4%多聚甲醛固定多聚甲醛固定24h;24h;(5)(5)洗涤，脱水，甘油明胶封片。洗涤，脱水，甘油明胶封片。4. 4. 结果结果酶反响阳性部位见蓝色或紫色甲簪颗粒。酶反响阳性部位见蓝色或紫色甲簪颗粒。5. 5. 对照对照去色胺底物。去色胺底物。6. 6. 生物学意义：生物学意义： (1)(1)含生物活性胺组织：肾上腺髓质，含生物活性胺组织：肾上腺髓质，APUDAPUD细胞细胞(2)(2)参与毒性胺解毒组织：肝细胞、肾小管、肠粘参与毒性胺解毒组织：肝细胞、肾小管、肠粘膜上皮。膜上皮。五、辅酶非依赖性脱氢酶琥珀酸脱氢酶五、辅酶非依赖性脱氢酶琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase, SDH)1、反响原理、反响原理四