生物信息学与PCR

1、第九章第九章聚合酶链反应聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction. PCR）评价：评价：* * PCR PCR是现今生物生命学科最关注、最爱用、是现今生物生命学科最关注、最爱用、 最欢迎的新技术。最欢迎的新技术。* * 被誉为：被誉为：2020世纪世纪8080年代出现的具有划时代年代出现的具有划时代 的、生命学科中革命性的新技术。的、生命学科中革命性的新技术。* * PCR PCR使生命学科发生变革，给生物医学的发使生命学科发生变革，给生物医学的发 展注入无限活力。展注入无限活力。* * 公认公认PCRPCR最具发展前景，最有生命力的一项最具发展前景，最有生命力的一项

2、 新技术。新技术。* * 最短时间获诺贝尔奖（最短时间获诺贝尔奖（86-9386-93年）。年）。* * 多么高的评价都不过分。多么高的评价都不过分。一、问题提出一、问题提出 背景背景: : 分子生物学、遗传学的兴起，分子生物学、遗传学的兴起， 反向生物学的诞生反向生物学的诞生 （核酸、遗传物质，基因型（核酸、遗传物质，基因型表型）。表型）。 共同障碍：共同障碍： 如何在短时间内如何在短时间内快速、获足够量、纯净的、快速、获足够量、纯净的、 特异的目的特异的目的DNADNA片段片段/ /基因供使用，可检测。基因供使用，可检测。 1 1基础理论研究的需要基础理论研究的需要 DNADNA重组、基因

3、克隆、重组、基因克隆、HGPHGP测序，探针制备测序，探针制备 2 2实际应用的需要实际应用的需要 基因工程（基因表达）、基因诊断、基因治基因工程（基因表达）、基因诊断、基因治 疗，基因预防等给人类带来希望。疗，基因预防等给人类带来希望。体内体内DNADNA的复制体系的复制体系 引物引物引物引物二、二、PCRPCR的基本概念的基本概念概念概念 由一对引物介导，在体外对特定由一对引物介导，在体外对特定DNADNA片段进行片段进行 快速、酶促、扩增技术。快速、酶促、扩增技术。 以拟扩增的以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别分子为模板，以一对分别与模板与模板5 5末端和末端和3 3末端互补的寡核苷

4、酸片段为引末端互补的寡核苷酸片段为引物，在物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重合成，重复这一过程，即可使目的复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。片段得到扩增。PCR反应循环反应循环前提：前提：人工合成一对特定引物作向导，人工合成一对特定引物作向导， 始动始动DNADNA合成。合成。酶促：酶促：体外试管内进行酶促生化合成体外试管内进行酶促生化合成 （非化学合成）。（非化学合成）。靶子：靶子：特导扩增目的靶序列（目的）。特导扩增目的靶序列（目的）。高效：高效：极微量模板、百万倍扩

5、增极微量模板、百万倍扩增快速：快速：短时高速完成实验。短时高速完成实验。内内 涵：涵： 三、三、PCRPCR工作原理工作原理 PCRPCR的基本原理的基本原理 变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制 PCRPCR过程：过程：3 3步曲步曲 + 1+ 1循环循环 高温变性高温变性 90909797 降温退火降温退火 45455555 适温延伸适温延伸 7272左右左右 反复循环反复循环变性延伸退火90 9540 6070 75 分四个阶段讲述其原理：分四个阶段讲述其原理：（一）高温模板变性（一）高温模板变性 制备好含有扩增靶序列制备好含有扩增靶序列/ /目的基因的样品目的基因的样品DNAD

6、NA （模板（模板DNADNA）。然后在高温下（）。然后在高温下（90 - 9590 - 95）使双）使双 键模板键模板DNADNA变性，解链，获得单链模板变性，解链，获得单链模板DNADNA，为，为DNADNA 合成作好准备。合成作好准备。（二）降温引物退火（二）降温引物退火 合成一对特导性引物，在合成一对特导性引物，在25 - 5525 - 55温度下，温度下， 引物与模板配对结合。引物与模板配对结合。引物的作用有三：引物的作用有三：定位、定向、定大小定位、定向、定大小 一对引物分别位不同模板一对引物分别位不同模板 DNADNA链上的靶序列的两端，链上的靶序列的两端， 两条引物各自结合在不

7、同两条引物各自结合在不同 的信息、非信息链上。的信息、非信息链上。 引物是通过严格碱基互补发挥识别、引物是通过严格碱基互补发挥识别、 结合和特异定位。结合和特异定位。 2 2定向：定向： DNADNA链有方向性从链有方向性从55端到端到33端，引物端，引物 结合也有方向性。结合也有方向性。 引物和模板引物和模板DNA 3DNA 3端结合，端结合， 以引物为起点的新合成链，以引物为起点的新合成链，55端锁定。端锁定。 遵循遵循DNADNA合成合成55端到端到33端的方向性，端的方向性， 引物只能引物只能33端延伸，端延伸， 两条引物两条引物33端均指向靶序列。端均指向靶序列。 在高温模板变性反应

8、体系中，加入过量（浓度大，在高温模板变性反应体系中，加入过量（浓度大，引物数量多）的一对引物，在较低温下（引物数量多）的一对引物，在较低温下（25 - 5025 - 50）大量的引物分别与各自相对应的单链模板大量的引物分别与各自相对应的单链模板DNADNA互补补互补补严格大碱基配对，由于引物量大，长度小，其退火、严格大碱基配对，由于引物量大，长度小，其退火、结合的速度远高于模板单链结合的速度远高于模板单链DNADNA之间的结合。之间的结合。3 3定大小定大小 引物决定两条引物之间的靶序列长度，一对引引物决定两条引物之间的靶序列长度，一对引物一旦设计合成，其扩产物长短不再变化。物一旦设计合成，其

9、扩产物长短不再变化。（三）适温引物延伸（三）适温引物延伸（适温新链合成）（适温新链合成） 加入选定的加入选定的DNADNA聚合酶，在其适宜温度（聚合酶，在其适宜温度（Taq Taq 酶为酶为65 - 7265 - 72）进行）进行DNADNA酶促合成反应，反应体系中的酶促合成反应，反应体系中的4 4dNTPdNTP（底物（底物A A、C C、G G、T T四种核酸），在引物四种核酸），在引物33端，端，在模板序列指导下，开始合成，即引物自在模板序列指导下，开始合成，即引物自5353端端延伸，合成一条与模板互补延伸，合成一条与模板互补 之新链。之新链。 反应体系中反应体系中DNADNA产量增加一

10、倍，（原模板产量增加一倍，（原模板+ +新合成新合成DNADNA，半保留复制），若以此产物，半保留复制），若以此产物DNADNA总量总量为模板重新合成反应，新反应体系中模板量实际为模板重新合成反应，新反应体系中模板量实际将增加一倍。将增加一倍。（四）循环指数扩增（四）循环指数扩增 重复前三个步骤，重复前三个步骤， 由于由于每次循环后产物可作为下一次反应模板，每次循环后产物可作为下一次反应模板，DNADNA总量和模板量均较上一次循环增加一倍，总量和模板量均较上一次循环增加一倍， 反复多次累积呈指数增加，如一分子反复多次累积呈指数增加，如一分子DNADNA成单链成单链后两个模板，一次循环后变为后两

11、个模板，一次循环后变为2 2分子分子DNADNA，变性后，变性后有有4 4个单链模板，个单链模板，3030次循环的次循环的 2 23030呈呈百万倍增加百万倍增加。PCRPCR原理原理模版模版目的扩增片段目的扩增片段5533PCRPCR原理原理高温模板变高温模板变性性目的扩增片段目的扩增片段3355PCRPCR原理原理2.2.降温引物退火降温引物退火上游引物：上游引物：下游引物：下游引物：5335PCRPCR原理原理3.3.适温引物延伸适温引物延伸PCRPCR原理原理4.4.循环指数扩增循环指数扩增) )高温模板变性高温模板变性PCRPCR原理原理2)2)降温引物退火降温引物退火PCRPCR原

12、理原理3)3)适温引物延伸适温引物延伸PCRPCR原理原理4)4)循环指数扩增循环指数扩增 (1)(1)高温模板变性高温模板变性PCR原理(2)(2)降温引物退火降温引物退火PCRPCR原理原理(4)(4)循环指数扩增循环指数扩增(3)(3)适温引物延伸适温引物延伸 DNADNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n) )，其中长片段以线性形式，其中长片段以线性形式扩增扩增 (2n+2) (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。，最终主产物片段长度在两个引物之间。预变性预变性(92-95(92-95 C,2-5m)C,2-5m)变性变性(92-95(92-95 C,30s)C,30

13、s) 复性复性(40-60(40-60 C,30s)C,30s) 延伸延伸(72(72 C,30-60s)C,30-60s) 总延伸总延伸(72(72 C,7m)C,7m)( (25-35)25-35)次次PCRPCR的一般过程：的一般过程：经过经过3030次的循环次的循环, , 扩增的扩增的DNADNA片段可达片段可达100100万倍以上。万倍以上。2402401625625611411452222282 20 00 0短片段（单链）短片段（单链864 42 2长片段（单链）长片段（单链）128128646432321616总片段（单链）总片段（单链）循环数循环数P

14、CR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533PCR PCR 循环循环- - 第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerasePCR PCR 循环循环 - - 第三步第三步 - - 引物延伸引物延伸靶序列 靶序列BiotinBiotin第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of

15、Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量 PCRPCR每次循环扩增一览表每次循环扩增一览表 (n0)(n0)循环循环 起始模板起始模板 55端锁定长链端锁定长链 短链靶序列短链靶序列 总拷贝数总拷贝数

16、 0 20 2 0 0 0 0 2 2 1 1 2 2 2 2 0 0 4 4 2 2 2 2 4 4 2 8 2 8 3 3 2 2 6 6 8 8 16 16 4 4 2 2 8 8 22 22 32 32 20 20 2 2 40 40 10 105 5 2 220+120+1 n n 2 2 2n 2n 2 2n+1n+1-2n-2 2-2n-2 2n+1n+1 ( (恒定不变恒定不变) )( (线性增加线性增加)()(近似指数增加近似指数增加) () (指数增加指数增加) )从表中可知，从表中可知， l 2020次次PCRPCR循环后，反应产物循环后，反应产物DNADNA链拷贝数链拷

17、贝数2 22020 起始模板可略去不计，起始模板可略去不计，55端长链数端长链数4040个，只个，只占总数占总数40/240/220203.53.510-5.10-5.比例相当小。比例相当小。l 当扩增当扩增3030次后，其占比例更小，产物中次后，其占比例更小，产物中 99.99%99.99%均为目的靶序列短链。均为目的靶序列短链。l可能合成少量小于靶序列的短小片段。由于可能合成少量小于靶序列的短小片段。由于进入下一循环后，引物结合不止，不可能大进入下一循环后，引物结合不止，不可能大量扩增。量扩增。( (二二)PCR)PCR操作流程操作流程加酶后参加酶后参数数时间时间温度温度变性变性30(30

18、(1m1m）90 - 9590 - 95退火退火30 - 6030 - 6037 - 5537 - 55扩增扩增60 - 9060 - 9070 - 7570 - 75循环总次循环总次数数25 - 3025 - 30次次 5 5、PCRPCR反应参数的设定（选择与优化）反应参数的设定（选择与优化）PCRPCR反应体系反应体系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多多 聚聚 酶酶Pfu DNA 多多 聚聚 酶酶引引 物物 和和 或或 和和* * 切记莫忘切记莫忘l 模板变性要充分，模板变性要充分，l 最好加酶前使模板充分变性最好加酶前使模板充分变性 变性成单链变性成单链

19、* * PCR PCR 反应六要素反应六要素 l 引物引物l 酶酶l dNTPl 模板模板l Mg2+l 缓冲液缓冲液（四）结果检测（显示）（四）结果检测（显示）l 一般采用琼脂矿凝胶电泳一般采用琼脂矿凝胶电泳- -澳化乙锭处理澳化乙锭处理紫紫外灯下观察法、荧光显示（外灯下观察法、荧光显示（PCR-EBPCR-EB法）法）l 注意设立严格对照：注意设立严格对照： DNA DNA分子量标准，分子量标准， 阳性对照，阳性对照， 阴性、空白对照阴性、空白对照l更精确的方法：更精确的方法： PCR-blot PCR-blot（转印后与已知探针、杂交）（转印后与已知探针、杂交） PCR-LP PCR-L

20、P（产物标记后作探针、杂交）（产物标记后作探针、杂交） PCR-HPLC PCR-HPLC（分析吸收峰）（分析吸收峰） 套式套式PCRPCR（另设计一对内引物、扩增更小片段）（另设计一对内引物、扩增更小片段）五、五、PCRPCR两个最关键因素两个最关键因素引物、酶引物、酶（一）引物（一）引物l 引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR PCR 产物的特异性产物的特异性取决于引物与模板取决于引物与模板DNADNA互补的程度。互补的程度。l 理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，序列， 就能按就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用其设

21、计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCRPCR就可将就可将模板模板DNADNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。 引物（引物（primerprimer）也称为寡核苷酸引物，常规的）也称为寡核苷酸引物，常规的PCRPCR反应需要反应需要两种引物，分别成为两种引物，分别成为55端引物和端引物和33端引物，或称为上游端引物，或称为上游/ /正向引物和下游正向引物和下游/ /反向引物。反向引物。 通常通常DNADNA及及mRNAmRNA序列的写法为序列的写法为5353，所以，所以55端引物与端引物与目的序列的目的序列的55末端序列相同，而末端序列相同，而33端引物与目的序列的端引物与目的序列的33末端序列反

22、向互补。末端序列反向互补。引物引物 它们作为它们作为DNADNA扩增的起始部分，能限定待扩增扩增的起始部分，能限定待扩增DNADNA序列的长度。序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有至少有151518 bp18 bp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物* * 如何设计如何设计PCRPCR引物引物要素之一要素之一（A A）引物来源：）引物来源： （1) 1) 购买成套检测试剂盒，简单省力、购买成套检测试剂盒，简单省力、 易出错、成本高易出错、成本高 （2) 2) 自

23、己合成自己合成 1 1）查文献、查序列库（计算机）查文献、查序列库（计算机） 直接查引物序列直接查引物序列合成；合成； 查靶序列自己设计查靶序列自己设计 2 2）依）依PCRPCR目的，选定靶序列上的两侧翼序列如目的，选定靶序列上的两侧翼序列如 作检测，靶序列应保守、特异（种、属、作检测，靶序列应保守、特异（种、属、 型特异）型特异） 3 3）必须有两条不同引物，扩增两条不同链，）必须有两条不同引物，扩增两条不同链，序列分析资料只能提供一个序列分析资料只能提供一个DNADNA链顺序。假定链顺序。假定是信息链的资料。是信息链的资料。 5 P2 33 P1 5l 信息链信息链5 35 3， 已知该

24、条信息链序列已知该条信息链序列/ /靶序列资料：靶序列资料：5 - T A T A A C5 - T A T A A C A T G A T G A A G A C G A G C A A G A C G A G C CACCAC/ CAG CGG CAG CGG/ CAC CGA CTC CAT CAC CGA CTC CAT TAATAACGTACG -3CGTACG -3必须据此序列置设两个引物：必须据此序列置设两个引物： 扩增信息链的引物扩增信息链的引物 扩增其互补链的引物扩增其互补链的引物 ( ( 知道知道DNADNA一条链序列，可依硷基互补一条链序列，可依硷基互补配对原则写出另一互

25、补链序列配对原则写出另一互补链序列 ） （4 4）谁的引物合成谁的链，但必须以对）谁的引物合成谁的链，但必须以对方链为模板，产物中的两条新链，一条是信方链为模板，产物中的两条新链，一条是信息链，另一条为与互补的非信息链。息链，另一条为与互补的非信息链。 （5 5）信息链引物的设计：）信息链引物的设计： 按信息链顺序，在按信息链顺序，在55分端选定部位，按分端选定部位，按碱基排列顺序照抄碱基排列顺序照抄10 - 2010 - 20个碱基，即信息个碱基，即信息链引物。合成新的信息链。链引物。合成新的信息链。 信息链引物：信息链引物： P1 P1 5ATGAAGACGAGCCAC5ATGAAGACG

26、AGCCAC（5 35 3）见图）见图 （6 6）非信息链引物的设计）非信息链引物的设计 在信息链的在信息链的 33端，选端，选10 - 2010 - 20碱基，写出其互碱基，写出其互补碱基，即为非信息链引物，将来以互补链为模补碱基，即为非信息链引物，将来以互补链为模板合成出新的非信息链，考虑到方向性。（板合成出新的非信息链，考虑到方向性。（5 5 33）l 非信息链引物：非信息链引物： P P2 2 5 5TTAATGGAGTCGGTGTTAATGGAGTCGGTG33 即按即按5 35 3写出，（表面上与信息链顺序反向）写出，（表面上与信息链顺序反向） 33 5P25P255TATAACT

27、ATAACATGAAGACGAGCCAC/ATGAAGACGAGCCAC/CACCGACTCCAGTTAACACCGACTCCAGTTAA3333ATATTGATATTGTACTTCTGCTCGGTGTACTTCTGCTCGGTG/GTGGCTGAGGTAATTGTGGCTGAGGTAATT55 P1 5 3 P1 5 3 P1 P1 5ATGAAGACGAGCCAC 3 5ATGAAGACGAGCCAC 3 （5 35 3） P2 P2 5TTAATGGAGTCGGTG 3 5TTAATGGAGTCGGTG 3 （5 35 3）（7 7）利用生物信息学）利用生物信息学 计算机网络分析计算机网

28、络分析 DNAsis DNAsis 软件。软件。 （配对情况及设计合理性）（配对情况及设计合理性）（8 8）合成与纯化）合成与纯化（B B）设计引物十大原则）设计引物十大原则l 引物的设计在引物的设计在PCRPCR中很重要。（三定作用）中很重要。（三定作用）l 总体考虑：总体考虑： 特异性、高效扩增特异性、高效扩增和和自由度自由度广泛应用广泛应用 长度长度：15 - 35 15 - 35 碱基碱基( mer( mer，nt )nt ) 最好最好20 - 25 nt 20 - 25 nt 。 过短：特异性降低，结合不牢过短：特异性降低，结合不牢 过长：成本高，特异性反而降低过长：成本高，特异性反

29、而降低 （不易结合）（不易结合） 碱基组成：碱基组成： 引物中四种碱基的分布最好是随机，引物中四种碱基的分布最好是随机，G+CG+C含量含量50%50%或或与目的片段相当。与目的片段相当。 G+CG+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+CG+C过过多易出现非特异条带。不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存多易出现非特异条带。不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。在。尤其尤其33端不应超过端不应超过3 3个连续的个连续的G G或或C C，因这样会，因这样会使引物在使引物在G+CG+C富集序列区错误引发。富集序列区错误引发。 引物内部不应有二级结构，避开产物的二级结构引物内部不应有二级结构，避开产物的二级结构区。影

30、响配对。区。影响配对。 引物之间特别是引物的两端之间不能有互补的序引物之间特别是引物的两端之间不能有互补的序列，减少引物形成列，减少引物形成“模板模板”，导致二聚体出现。一，导致二聚体出现。一对引物间对引物间不应多于不应多于4 4个连续碱基的同源性或互补性个连续碱基的同源性或互补性。 引物引物33端端 必须确保严格与目的片段互补，不能必须确保严格与目的片段互补，不能进行任何修饰，不能发生错配。进行任何修饰，不能发生错配。 特别是最末及倒特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致基不配对而导致PCRPCR失败失败 33端未

31、位碱其端未位碱其少选少选A A。 以以T.C.GT.C.G为好。减少错配，避免引物不能延伸。为好。减少错配，避免引物不能延伸。另外另外33端最好选保守的三个碱基序列（如保守的端最好选保守的三个碱基序列（如保守的aaaa密码）密码） 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%70%或有或有连续连续8 8个互补碱基同源个互补碱基同源。 扩增目的片段的长度。扩增目的片段的长度。 引物扩增跨度：引物扩增跨度： 以以200-500bp200-500bp最好，最好，1kb1kb以以 下为宜。下为宜。3kb3kb3kb3kb效率大大下去降效率大大下去降, ,也能也能 扩增

32、扩增10kb10kb以上（困难）以上（困难） 所用引物浓度所用引物浓度 引物纯度最好达引物纯度最好达PAGEPAGE电泳纯、电泳纯、HPLCHPLC纯。纯。 引物浓度引物浓度0.1 - 0.5 - 1mol/L0.1 - 0.5 - 1mol/L或或1010 100pmol100pmol，以最低引物量产生所需要的结果，以最低引物量产生所需要的结果 为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性 扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 两引物浓度为两引物浓度为1:11:1引物引物55端具包容性端具包容性，可容忍不配对序列存在，可

33、容忍不配对序列存在，据此可按需设计附加序列。据此可按需设计附加序列。 此附加序列配对时开始此附加序列配对时开始55端游离，以后因端游离，以后因已进入产物序列，便可扩增，如插入酶切位点，已进入产物序列，便可扩增，如插入酶切位点，调控元件，等调控元件，等。 密码子的简并密码子的简并 如扩增编码区域，引物如扩增编码区域，引物33端端不要终止于密码子的第不要终止于密码子的第3 3位，因密码子的第位，因密码子的第3 3位位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。易发生简并，会影响扩增特异性与效率。l 综上所述我们可以归纳综上所述我们可以归纳十条十条PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则： 引物应用核酸系列

34、保守区内设计并具有特异性。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。产物不能形成二级结构。 引物长度一般在引物长度一般在15-3015-30碱基之间。碱基之间。 G+C G+C含量在含量在40%-60%40%-60%之间。之间。 碱基要随机分布。碱基要随机分布。 引物自身不能有连续引物自身不能有连续4 4个碱基的互补。个碱基的互补。 引物之间不能有连续引物之间不能有连续4 4个碱基的互补。个碱基的互补。 引物引物55端可以修饰。端可以修饰。 引物引物33端不可修饰。端不可修饰。 引物引物33端要避开密码子的第端要避开密码子的第3 3位。位。 * 酶及其浓度酶及其浓度要素

35、之二：要素之二： DNADNA聚合酶聚合酶 酶是酶是PCRPCR成功与否的另一关键因素成功与否的另一关键因素( (详见后进展详见后进展一节一节).).它决定了：它决定了： 酶促反应能否进行；酶促反应能否进行； 特异性催化特异性催化( (反应、校对反应、校对) )； 效率效率 ； 速度速度l常用的常用的TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶从栖热水生杆菌中提纯的天然酶。从栖热水生杆菌中提纯的天然酶。l催化一典型的催化一典型的PCRPCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U2.5U（指总反应体积为（指总反应体积为100ul100ul时）时）l浓度过高可引起非特异性扩增，浓度浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少过低则合成产物量减少* * dNTPdNTP质量与浓度质量与浓度要素之三要素之三l dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系