RNA干扰抑制EphB4基因表达对胰腺癌PANC1细胞的影响

1、.大连医科大学硕士学位论文RNA干扰抑制EphB4基因表达对胰腺癌PANC-1细胞的影响姓名：李斌申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：赵作伟201106：RNA干扰抑制EphB4基因表达对胰腺癌PANC1细胞的影响硕士生姓名：李斌 指导教师：赵作伟教授 专业名称：外科学摘要目的：胰腺癌是一种恶性程度很高的消化系统肿瘤，它严重危害着人类的生 命健康。由于它发病隐匿、进展迅速，传统治疗方法的效果不能令人满意，治疗 困难，预后极差，因此研究出诊治胰腺癌的新方法显得尤为重要。近年来，随着 基因治疗技术的迅速发展以及胰腺癌相关基因研究的不断深入，胰腺癌的基因诊 断和基因治疗正在进一步的探索中。肿瘤的

2、血管生长及形成是促进肿瘤发生发展和侵袭转移的重要因素，所以抑 制胰腺癌的血管形成，降低胰腺癌组织中的血管含量，阻止其快速增长就显得尤 为重要。EphB4受体促进了血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，参与调控胚胎 期血管形成过程中的动静脉分化。目前，有文献报道EphB4受体在胰腺导管细胞 癌中的高表达与肿瘤血管的生成及侵袭性有密切相关性。RNAi通过外源性或内源性的双链RNA(dsRNA)，特异性结合了与dsRNA 序列互补的mRNA，诱导该mRNA的降解，沉默该基因的表达，属于转录后水平 的基因沉默。目前，它的应用范围非常广，可用于肿瘤基因功能分析和调控信号 转导通路等方面，为肿瘤的基因治疗提

3、供新的目标和途径。本实验通过构建EphB4基因的siRNA真核表达载体，转染胰腺癌PANC1细胞 后，研究RNAi对PANC1细胞EphB4基因的表达和细胞增殖、迁移行为的影响，为 以后进一步研究胰腺癌基因治疗提供基础。方法：软件分析EphB4基因的mRNA结构，筛选出拟干扰靶位点，构建 EphB4基因的干扰质粒pSIRENRetroQZsGreenEphB4和阴性对照质粒 pSIRENRetroQZsGreen-N，经过测序鉴定后，提取重组质粒转染PANC1细胞；实验分成空白对照组、pSIRENRetroQZsGreenEphB4组和pSIRENRetroQ- ZsGreen-N组，进行体外

4、实验；在重组质粒转染细胞48h后，用RT-PCR和Westernblot分别测定EphB4 mRNA和EphB4蛋白的相对含量，观察各重组质粒 瞬时转染PANC1细胞后对EphB4基因表达的影响；MTT测定细胞增殖能力；划痕迁移实验检测细胞的迁移能力。结果：测序鉴定证明重组质粒pSIRENRetroQZsGreenEphB4和pSIREN RetroQZsGreen-N构建成功；瞬时转染48h后，脂质体+干扰质粒组PANC1细 胞中EphB4 mRNA的表达水平较空白组、脂质体组、干扰质粒组和脂质体+对照 质粒组显著下降(P<005)；空白组、脂质体组、干扰质粒组和脂质体+对照质粒 组四

5、组间比较，差异不明显(P>005)；Westernblot法测定发现，脂质体+干扰 质粒组PANC1细胞中EphB4蛋白的表达水平较空白组和脂质体+对照质粒组显著下降(P<005)；空白组和脂质体+对照质粒组两组间比较，差异不明显(P>005)；抑制EphB4基因的表达使PANC1细胞的增殖能力有所减弱，细胞的迁 移能力与对照组比较有所下降。结论：成功构建靶向EphB4的siRNA真核表达载体并有效转染胰腺癌 PANC1细胞。干扰质粒能有效地抑制胰腺癌PANC1细胞EphB4基因的mRNA 和蛋白表达，同时PANC1细胞的体外增殖和迁移能力明显下降。关键词：胰腺癌PANC一1

6、EphB4RNA干扰2The influence of RNA interference suppression EphB4 expression for the PANC-1 cells of pancreatic cancerMaster degree candidate：Li Bin Supervisor：Professor Zhao Zuowei Maj or：SurgeryAbstraetObieetive：Pancreatic cancer is a higldy malignant tumor of digestive system，and it is seriously har

7、m to humanS life and healthBecause of its hidden disease and rapid progress，the effect of traditional treatment is not satisfactoryIts treatment is very difficult and prognosis is very poor，SO it is very important to developed a new methodof diagnosis and treatment of pancreatic cancerIn recent year

8、s，with the rapid development of gene therapy and genetic research of pancreatic cancer，gene diagnosis and gene therapy of pancreatic cancer are being further exploredThe blood vessel growth of pancreatic cancer plays a very important role in the development and metastasis of tumor，SO it is very impo

9、rtant to inhibit the growth of pancreatic blood vessels and prevent rapid growth of the tumorEphB4 receptor promotes the sprouting，migration，proliferation and tube formation of endothelial celland regulates arterial and venous differentiation during embryonic angiogenesisIn the present，it has been r

10、eported that high expression of EphB4 receptor in pancreatic ductal cell carcinoma is closely related to tumor angiogenesis and invasionRNA interference(RNAi)is a posttranscriptional gene silencing，it Can triggerposttranscriptional control procedures and lead to degradation of specific single scraIl

11、ded mRNARNAi has been successfully used in gene function and upstream and do、vns臼e锄molecular intemctions of signal transduction system，and provide a new strategy for cancer therapyIn this study，eukaryotic expression plasmid vector of targeting EpllB4 Wasconstnlcted and transfected to PANC1 pancreati

12、c cancer cells to research the inhibitionof RNAi for PANC1 cells on gene expression of EphB4，cell growth and migrationItprovides the basis for gene therapy of pancreatic cancer in the future·Methods：software analyzed mRNA of EphB4 gene and selected target sitesConstructing EphB4 recombinant euk

13、aryotic expression plasmid pSIREN-RetroQ_3ZsGreen·EphB4 and constructing a negative control plasmid pSIRENRetroQ ZsGreen-NAfter sequencing，the recombinant plasmid was extracted and transfected to PANC一1 cells；(虿)The experiment Was divided into control group，pSIREN-RetroQ ZsGreen··EphB

14、4 group and pSIREN·-RetroQ··ZsGreen-N group for the vitro experiments；(查)Transfecting plasmid to cells after 48h，恤relative amount of EphB4 mRNA andprotein were measured by RT-PCR and Western-blotting，and observeing the inhibition of the recombinant plasmids for the expression of EphB4

15、 gene of PANC-1 cells；Cell proliferation Was determinated by MTT；Scratch migration assay detected the ability of cell migration Resuits：()sequencing proved that the recombinant plasmid pSIREN·-RetroQ·- ZsGreen··EphB4 and pSIREN··RetroQ·-ZsGreen-N were successfully

16、constructed； (至)Transient transfecting after 48h，the expression level of EphB4 mRNA in the group of liposomes and interfere plasmid more decreased than the control group，the group of liposome，the group of interfere plasmid group，and the group of control plasmid liposome(P<005)There were not signi

17、ficant difference between the control group， the group of liposome，the group of interference plasmid and the group of controlplasmid liposome(P>O05)；Westernblot method showed that the expression level of EphB4 mRNA in the group of liposome interference plasmid more decreased than the control grou

18、p and the group of control plasmid liposome(P<005)There were not significant difference between the blank group and the group of control plasmid liposome(P>005)；(研dae inhibition of EphB4 expression weakened the proliferation of PANC-1，and the ability of cell migration compared惭tIl the control

19、group decreasedConclusion：The siRNA eukaryotic expression plasmid vector of targeting EphB4Was successful constructed and effectively transfected PANC一1 pancreatic cancer cellsRecombinant plasmid Can inhibit the expression of EphB4 gene mRNA and protein of pancreatic cancer PANC-1 cells，and the grow

20、th and migrationof PANC-1cells were significantly decreasedKey words：pancreatic CanCer PANC-1 EpllB4 RNA interference4RNA干扰抑制EphB4基因表达对胰腺癌PANC1细胞的影响硕士生姓名：李斌 指导教师：赵作伟教授 专业名称：外科学日IJ舌胰腺癌是一种高度恶性肿瘤，近年来它的发病率在全世界逐年上升。在西方 发达国家胰腺癌已成为十大恶性肿瘤之一。在我国，该病的发病率也有增高的趋 势。胰腺的解剖位置深，较隐匿，难以得到早期诊断及有效治疗，大部分患者发 现肿瘤时已属于晚期，肿瘤经过

21、血管、淋巴系统等途径转移，需要全身性的治疗。 目前，胰腺癌的主要治疗手段包括化疗、放疗、手术及联合治疗。但是，手术切 除率较低，术后约80-90患者复发【l训，并且对很多化疗药物或放疗均不敏感， 以至治疗效果不佳，不能令人满意，因此探索新的有效治疗策略和方案显得非常 重要。随着基因技术的迅速发展，与胰腺癌有关的基因不断被发现和克隆，为胰 腺癌的发病机制、诊断和治疗等研究提供了很多新的靶点。Eph家族是酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases，RTKs)中最大的亚 家族，它们结合ephrin配体，共同转导细胞间信号。Eph家族可分为两个亚群，分 别是EphA和Eph

22、B。同样，ephrin配体也可分为两个亚群，分别是ephrinA和 ephrinB。研究表明，每个亚群里一个受体可结合多个配体，从而发挥不一样的作 用。例如EphA4可结合ephrinA配体，也可结合ephrinB配体15订J。Eph受体和ephrin配体的过表达与肿瘤的恶性进展有关，它们的部分成员已被证明在乳腺癌瞵。1 ，肺癌1¨，胃癌121，结肠癌13,14，子宫内膜癌【15,16】，黑色素瘤【17,IS等中表达。而Eph 家族中的EphB4受体在肿瘤血管方面的研究尤为引人关注。EphB4受体与ephrinB2 配体高度特异性结合，促进了血管内皮细胞的芽生、增殖、迁移和管腔形成&

23、#168;犯UJ。EphB4受体在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、恶性间皮瘤等中表达。 RNAi是一种转录后基因沉默技术(PTGS)，把一小段siRNA导入细胞，特异性结合内源性靶基因，诱导其mRNA的降解，从而抑制该基因的表达【211。近年来， 研究人员常利用RNAi特异性下调肿瘤相关基因的表达，研究该基因在肿瘤发生发 展中的作用，为肿瘤的早期诊断和基因治疗提供靶位剧22J。本课题前期研究了16842个基因点的基因表达谱芯片，筛选出与胰腺癌相关 的差异表达的基因，结果表明EphB4基因在4例胰腺癌组织中均表达上调，并且 在淋巴结转移组织中表达上调。通过免疫组化SP法和RT-PCR方法检

24、测胰腺导管 细胞癌中EphB4基因的表达及肿瘤微血管密度，结果表明EphB4受体在胰腺导管 细胞癌中的表达程度与肿瘤血管的生成和癌细胞的侵袭性有正相关性。本实验应用RNA干扰技术，构建EphB4基因的siRNA真核表达载体pSIREN Re仃oQZsGreenEphB4，转染PANIC1细胞系，观察干扰质粒下调EphB4的基因 表达对胰腺癌细胞增殖和迁移能力的影响。通过以上研究，探讨EphB4基因在胰 腺癌发生发展过程中的意义，为胰腺癌的基因治疗方面提供靶位点。6第一部分靶向EphB4的siRNA表达载体的构建刖吾RNAi是一种转录后基因沉默技术(PTGS)，把-d,段siRNA导入细胞，特异

25、性 结合内源性靶基因，诱导其rnRNA的降解，从而抑制该基因的表达。siRNA表达 载体可在细胞中稳定表达，发挥阻断基因表达的作用。我们构建了特异性抑制 EphB4基因的siRNA表达载体，转染进胰腺癌细胞中，下调了该基因的表达，为 进一步探讨其在胰腺癌发生发展中的作用奠定了基础。材料与方法1、质粒 质粒pSIREN。RetroQZsGreen(图11)，购自宝生物工程(大连)有限公司。它含有Pu6启动子(Pu6promoter)，能启动shRNA的表达；它的Pc·MVIE启动子能 够使绿色荧光蛋白转录启动，观察siRNA真核表达载体的转染效率；Amp抗性基 因可用于筛选阳性克隆细菌

26、。酶切位点是BamH I和EcoRI，它们中间的区域为插入片段(shRNA)的位置，整个质粒序列全长是6568bp。图l-1 pSIREN-RetroQZsGreen质粒结构2、主要试剂和材料Ecoli Competent Cells JM 1 09宝生物工程(大连)有限公司限制性内切酶BamHI宝生物工程(大连)有限公司7限制性内切酶EcoRI宝生物工程(大连)有限公司RT-PCR试剂盒宝生物工程(大连)有限公司T4DNA连接酶宝生物工程(大连)有限公司琼脂凝胶DNA回收试剂盒宝生物工程(大连)有限公司高纯度质粒提取试剂盒宝生物工程(大连)有限公司LB培养基宝生物工程(大连)有限公司DNA

27、marker DL2000宝生物工程(大连)有限公司 3、主要实验仪器细胞培养箱，倒置显微镜，超净工作台，台式离心机，-80超低温冰箱， 高速冷冻离心机，37"(2温箱，恒温水浴箱，温控摇床，凝胶成像系统，电子天平， DNA电泳仪，PCR仪。4、方法41 EphB4特异性siRNA序列的选择由Gene Bank中查找人EphB4基因序列(NM 004444)，应用Ambion公司 (http：wwwambioncom)RNAi设计软件并参考相关文献，进行全基因的扫描和 序列分析，然后根据siRNA设计的原则寻找符和特征的靶位点，使用BLAST技 术在基因库中确认没有与选中的mRNA序

28、列同源的基因，保证靶基因具有序列特 异性。最后决定的靶位点为5GGUGAAUGUCAAGACGCUG3。另外，再设计 随机阴性对照序列为：5GCCACUAUGCGCUCUAGAU3，应用BLAST分析， 发现该阴性对照序列与任何人类基因均无同源性。42 shRNA序列DNA模板的设计按照选定的干扰靶位点设计相应的shRNA DNA表达模板：设定siRNA目标 序列为正义链(sense)，其反向互补序列为反义链·(antisense)，中间是一个15个 碱基(51'AGTGCTCCTGGTTG3)的Loop结构，令其能反向互补形成发夹结构shRNA(small hairpin

29、RNA，shRNA)。shRNA的转录终止序列采用T1耵结构，两端分别为BamHI(GATCCG)和EcoRI(Cy'CTTAA)酶切位点。shRNA的两条 DNA单链对由宝生物工程(大连)有限公司合成。表I-I shRNA的DNA序列shRNA-EphB4(5-BamHI+sense+loop+antiseme+termination signal+EcoRI·3)5型垡KX粥Af6lT(、，IAAGAC妇CTlG塑圈碧笪竖壅磐筵窖CAGC：CHlCl飓ACAT陀ACCm扯9邸3·90CACmCAGTTCTGOGAC垫璺篓氍鎏g垄苤垄苤GTOGCAGAACTAGT

30、GG覆强匿目!自蛩5843 shRNA与pSIRENRetroQZsGreen质粒的连接 431两条sm斟A的DNA单链退火形成双链DNA 将合成的DNA单链稀释成0010Drtl，各取sense oligo1“lantisense oligo1肛l牛STEBuffer1 mH207山六STE Buffer：1 0mM Tris pH80，50mM NaCI，l mM EDTA94。C水浴5分钟，然后停止加热冷却至30水浴90分钟，4。C保存。 432质粒pSIRENRetroQZsGreen的处理 因shRNA的DNA模板在其两端引入了BamHI和EcoRI酶切位点，在pSIRENRetro

31、QZsGreen的多克隆位点中也有BamHI和EcoRI的酶切位点(见图 11)，故用BamHI和EcoRI酶切pSIRENRetroQZsGreen质粒使其线性化，反应 体积为201xl，37过夜。用1的琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶回收试剂盒回收， 获得酶切线性的质粒。433 shRNA的DNA链与pSIRENRetroQZsGreen质粒的连接 采用209l反应体系，分别加入溶液如下：酶切线性质粒51xl退火的DNA链5山SolutionI1 01xl于16。C充分混匀，30分钟后得到重组的pSIRENRetroQZsGreenEphB4质粒。 44转化及扩增重组质粒(1)1009l感受态细

32、胞移入灭菌处理后的试管内； (2)加入1 01xl重组pSIREN-RetroQ-ZsGreen-EphB4质粒； (3)冰中放置30分钟；(4)42。C放置45,-60秒；(5)冰中放置2"-'3分钟； (6)加入37。C预温好的LB培养基，使终体积为lml； (7)37"C下以160"-225rpm振荡培养1小时； (8)涂布琼脂平板培养基；(9)37"C过夜培养。 45按碱裂解法抽提质粒 按质粒抽提试剂盒的步骤如下：(1)吸附柱加入500tl平衡液，以13000rpm离心lmin；9(2)5"-'15rra过夜培养的菌液，

33、分次加到15ml离心管中，以13000rpm离心 lmin，倒掉上清；(3)往留有菌体沉淀物的离心管中加入5001al P1溶液(已加入RNase A)，用涡 旋振荡器去沉淀细菌；(4)往离心管内加入P2溶液，上下翻转57次，时间不超过4min，再往离心 管内加入溶液P3，上下翻57次，充分混匀，出现白色的絮状沉淀，以13000rpm离心10min，吸取上清到另一个离心管；(5)将上清液分次转入到过滤柱里，以1 3000rpm离心2min，把收集到的溶液 转移到干净的管里；(6)把收集到得溶液分两次加到吸附柱里，以13000rpm离心lmin，把收集管 的废液倒掉；(7)往吸附柱里加入5001

34、,tl的去蛋白液，以13000rpm离心1min，把收集管的废 液倒掉；(8)往吸附柱里加入7009l的漂洗液，以13000rpm离心1min，倒掉收集管内的 废液，再往吸附柱里加入500111的漂洗液，以13000rpm离心lmin，把收集管内的 废液倒掉；(9)把吸附柱放回到收集管内，以13000rpm离心2min，除掉吸附柱上的废液，在室温下晾干乙醇；(10)把吸附柱放到离心管中，往吸附膜滴加2001tl洗脱缓冲液，室温下放置 2min，以13000rpm离心lmin，把质粒收集入离心管里：(11)取出51tl得到的质粒溶液，将其稀释后，用紫外分光光度计测OD值，粗 略定量，用-20冰箱

35、保存，待用。46阳性克隆筛选与测序鉴定461阳性克隆筛选 从干扰质粒和阴性对照质粒的转化平板上各挑取8个单菌落，用引物pSIRENF3P2进行PCR扩增，1琼脂糖凝胶电泳。表1-2引物序列462测序鉴定 把重组质粒送交宝生物工程(大连)有限公司测序，以便鉴定序列的准确性。lO经测序确认的siRNA表达载体命名为pSIRENRetroQZsGreen-EphB4，阴性对照质粒命名为pSIRENRetroQ-ZsGreen-N。结果1、阳性克隆筛选 各挑取8个单菌落，用引物pSIRENF3P2进行PCR扩增，1琼脂糖凝胶电泳图片(图12)，中间六条带的孔是DNA Marker，左侧8个孔是干扰质粒

36、，右侧8个孔是阴性对照质粒，PCR扩增为单一条带，大小约为284bp。12345678M12345678图I-2质粒PCR产物2、重组质粒测序结果 将重组干扰质粒和阴性对照质粒测序，测得的结果与设计序列完全相符合，表明重组质粒构建成功。截取部分测序结果如图(图13)。A图13质粒测序图谱A：pSIRENRe仃oQ-ZsGreen-EphB4；B：pSIREN·RetroQ-ZsGreen-N讨论EphB4受体是酪氨酸蛋白激酶受体亚家族中的其中一员，它通过双向信号途 径与邻近的内皮细胞上的配体互相作用，促进了血管内皮细胞的增殖、迁移和管 腔形成。RNAi是近几年新兴的基因沉默技术。它通

37、过外源性或内源性的双链RNA (dsRNA)，特异性结合了与dsRNA序列互补的mRNA，诱导该mRNA的降解， 沉默该基因的表达。因为RNAi作用在转录后水平，所以被称为转录后基因沉默 (PTGS)。目前，发挥这种生理功能的物质被认为是小干扰RNA(siRNA)，即长 度是2123个碱基的双链小RNA，是较长的dsRNA被Dicer酶切割后形成的，然 后siRNA和RNA酶结合，形成了RNA诱导沉默复合体(砒SC oRISC结合与siRNA12特异性互补的靶基因mRNA，接着核酸酶切割mRNA，使其无法进行转录，从而 抑制基因表达。siRNA序列的设计是RNAi中的关键环节，设计和筛选出有效

38、的siRNA序列 才能达到沉默基因表达的效果。siRNA序列的设计原则如下：1、由靶基因mRNA 的起始密码开始，查询到类似“AA”或者“NA”的序列，它们3端的1 9个碱基可以 成为siRNA的候选序列；2、候选序列中GC的含量最好在4555左右；3、排 除非编码区的序列，这些序列含有较多调控蛋白结合的序列，会妨碍RISC结合 mRNA；4、避免出现GGG，免得影响了siRNA的解链；5、用BLAST比较选择 好的序列，排除掉那些与其他编码序列或EST同源的序列，以确保目的序列的特 异性。shRNA序列的设计也是RNAi的重要部分。设计shRNA的时候，要调整好它 的正义链及反义链的位置、拌

39、环碱基的序列及长度等。研究表明【23J，正义链及反 义链的位置关系到siRNA能否成功形成以及RNAi能否达到预期的干扰效果。如 果把正义链放在shRNA的3端，由shRNA被Dicer酶作用后产生的siRNA可能无 法与靶基因互补结合，导致干扰失败。Paddison24】等发现，由shRNA在细胞内被 酶作用后形成的siRNA，干扰效果与直接合成好的siRNA是一样的。siRNA的制备方法是RNAi技术的重要研究内容。现在常用的制备方法主要 有：体外转录法、体外消化法、化学合成法、表达框架法以及siRNA表达载体法。 体外转录法、体外消化法和化学合成法都是直接制备好siRNA，通过转染等方法

40、 导入细胞内。但是，直接导入的siRNA稳定性不够，容易在短期内被核酸酶降解， 对特异性mRNA的干扰时间短，所以其应用范围不大，目前主要应用于siRNA的 筛选过程。siRNA表达框架法和表达载体法是利用转录元件或合适的载体，把 siRNA加入到它们中，转染入细胞内，从而在细胞内长期稳定地表达siRNA。目 前，最常用的是siRNA表达载体。Sui等f25】报道利用siRNA重组表达载体，在细 胞内长期稳定地表达siRNA，下调靶基因表达的方法。表达载体需要合适的启动 子来启动siRNA的表达，现在我们多采用人源和鼠源的U6启动子以及人的H1 启动子的其中一种，它们都属于RNA聚合酶III启

41、动子(pollII)26-301。本实验选择构建siRNA真核表达载体法获得siRNA。本研究使用的 pSIRENRetroQZsGreen质粒是一个真核表达质粒，它含有Pu6启动子(Pu6 promoter)，能启动载体上的shRNA表达；它的PcMVIE启动子能够使绿色荧光蛋 白转录启动，观察siRNA真核表达载体的转染效率；Amp抗性基因便于筛选阳性 克隆细菌。载体转录的终止以6个连续胸腺嘧啶(T)为终止信号。把BamHI和 EcoRI两个酶切位点结合到shRNA序列的两端，以便该序列连接到真核质粒上的 BamHI和EcoRI之间。本实验把将外源性shRNA插入到pSIRENRetroQ

42、ZsGreen13质粒的BamHI和EeoRI酶切位点之间，来构建pSIRENRe仃oQZsGreenEphB4的 干扰载体。本实验构建的pSIRENRe仃oQZsGreen-EphB4干扰载体为下一步的基因转染 和进一步探索Epha4的基因功能奠定了基础。实验结果表明EphB4基因干扰质粒 的序列正确，siRNA表达载体构建成功，可以继续进行抑制EphB4基因表达后对胰腺癌细胞的影响的研究。14第二部分EphB4干扰质粒对PANC一1细胞的影响刖舌EphB4受体能促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，参与调控胚胎期血 管形成过程中的动静脉分化。但它的异常表达在胰腺癌的发生发展中起到什么作用

43、，目前没有相关的报道。本实验构建pSIRENRe仃oQZsGreenEphB4的干扰载 体并转染PANC1细胞系，观察下调EphB4基因表达后对胰腺癌PANC1细胞增 殖和迁移能力的影响，为胰腺癌在分子水平的诊治提供基础。材料与方法l、主要试剂和材料DMEM高糖培养基大连绿竹科技有限公司标准胎牛血清大连绿竹科技有限公司胰酶大连绿竹科技有限公司Lipofectamine聊2000美国Invitrogen公司DEPC美国Sigma公司Trizol试剂美国GIBCO公司RT-PCR反应试剂盒晶美生物公司DNA marker DL2000美国MBI公司EphB4一抗美国Bioworld公司 辣根酶标记

44、山羊抗兔IgG北京中杉金桥生物技术有限公司 ELC发光试剂盒上海普飞公司二十四孔板大连绿竹科技有限公司六孔板大连绿竹科技有限公司96孔培养板大连绿竹科技有限公司MTT大连绿竹科技有限公司DMSO大连绿竹科技有限公司目的基因与内参引物宝生物大连有限公司 2、主要实验仪器荧光显微镜，酶标仪，细胞培养箱，倒置显微镜，超净工作台，高速冷冻离 心机，台式离心机，一80超低温冰箱，恒温水浴箱，37"C温箱，温控摇床，凝 胶成像系统，电子天平，PCR仪，DNA电泳仪。3、质粒 为第一部分成功构建的重组质粒载体pSIRENRetroQZsGreenEphB4、pSIREN-RetroQ·Z

45、sGreen-N。4、细胞系 人胰腺癌PANC1细胞系购自中科院上海生化与细胞所细胞库。 5、实验方法51胰腺癌PANC1细胞培养、传代、冻存和复苏 人胰腺癌PANC1细胞，培养体系为含10FBS的DMEM高糖培养基，于37、10C02的培养箱中培养。511细胞传代(1)取对数生长期的细胞，倒掉旧培养液，加PBS 5ml，洗3次，倒掉PBS； (2)加入适量胰酶(1-一2m1)，37下消化3min(在显微镜下看见细胞疏松，贴壁不紧可停止)；(3)加入3ml含1 0FBS的培养液来终止消化； (4)吹打，混匀，吸出加入离心管，离心1000rpm，8min，倒掉上清； (5)加入培养液，吹打，混匀

46、，制成单细胞悬液； (6)拿两个细胞培养瓶，分别加入15ml含有10FBS的DMEM高糖培养液； (7)把第5步的细胞悬液分别加入两个培养瓶中； (8)扭松培养瓶的瓶盖，放置于37。C、10C02的培养箱中培养。 512细胞冻存(1)取对数生长期的细胞，倒掉旧培养液，加入PBS 5ml，洗3次，倒掉PBS； (2)加入胰酶(1"-2m1)，37。C下消化3min(显微镜下看见细胞疏松，贴壁不紧可停)；(3)至lJ超净台操作，加入3ml含10FBS的培养基去终止消化； (4)吹打，混匀，加入离心管，离心1000rpm，8min，倒掉上清液； (5)以7：2：1的比例各加入无血清培养基、

47、FBS及DMSO，配好冻存液，吸3ml冻存液加到离心管里，混匀，制成单细胞悬液； (6)细胞悬液加到两个无菌的冻存管里，旋紧盖子，用封口膜封口； (7)4。C放置30rain，一20放置30min，然后挂在液氮罐口过夜； (8)第二天投入液氮(一1 96。C)中，可长期保存。513细胞复苏 (1)从液氮罐中快速取出PANC1细胞的冻存管，放到己预热好的37C水浴箱里，快速解冻，lmin内完成，不要让外来的液体进入管内，用75酒精棉球擦拭后，放入超净台；16(2)混匀，吸取细胞悬液到5ml培养液的离心管里，室温下离心800rpm，5min， 倒掉上清；(3)加入2ml含有10FBS的DMEM高糖

48、培养液； (4)吹匀悬浮细胞，吸取混匀的细胞悬液到培养瓶中； (5)旋松培养瓶的瓶盖，放到37。C、10C02的培养箱中培养； (6)第二日换培养液继续培养。52细胞转染用脂质体LipofectamineaM2000进行转染，在6孔板上进行实验。转染前24h， 对处于对数生长期的细胞用胰酶消化后进行计数，调整癌细胞的浓度，将5x105 个PANC1细胞接种至6孔板，用没有抗生素的DMEM高糖培养基(含有10FBS) 培养24h后，使转染时细胞融合度达60"-'80。按照脂质体Lipofectaming刑2000 说明书进行转染：(1)转染1h前将500p1无血清的DMEM高糖

49、培养液换至6孔板中； (2)40烬的质粒混在2501d无血清DMEM高糖培养基中，轻轻摇匀；(3)把1 0111脂质体Lipofectamine刑2000与250p1无血清DMEM高糖培养基混 合，轻轻摇匀，室温下孵育5mira(4)5min后，把脂质体与质粒混合，室温下孵育20min，使质粒和脂质体的复 合物充分形成；(5)6孔板中每孔加入500p1脂质体一质粒复合物，前后移动培养板，与培养基混匀；(6)将培养板送入37。C、10C02的细胞培养箱中培养；(7)4-一6h后更换含有1 0FBS的DMEM高糖培养基，继续在细胞培养箱内培 养48h。53荧光显微镜检测转染效率 将消毒处理后的盖玻

50、片置于六孔板的孔底，5×105个PANC1细胞细胞悬液铺于其上，24h后待细胞融合率达60",-80时，用脂质体一质粒复合物转染细胞， 培养48h后，取出盖玻片，用冰PBS洗2次，然后在荧光显微镜下观察，照相保 存后用AdobePhotoshop CS软件处理图像，检测转染效率。54 RT-PCR检测EphB4基因mRNA表达541 RNA的提取(1)取出6孔板，倒掉培养基，冰PBS洗涤23次；(2)裂解：每孔加入Iml Trizol试剂，在冰上反复吹打、混匀，移至EP管，冰浴10mira(3)分相：加入02ml氯仿，用力震荡15s，室温下静置5min，在低温高速离心17机

51、中以4"C、12000rpm离心10min，分为三层，上层为RNA相； (4)RNA沉淀：将上层移至新的EP管内，加入05ml异丙醇，在一20下静置3h，然后以4、14000rpm离心10min； (5)RNA清洗：吸干上清，加入70的乙醇05ml，以4"C、14000rpm离心5min； (6)RNA干燥：吸净上清，勿触及沉淀，置于超净台吹干，管底可见白色沉淀； (7)RNA再次溶解：加入101xl DEPC水溶解RNA，进行RNA定量后置于一80保存。542总RNA的定量取2pl总RNA溶解于4981d DEPC处理水中，在紫外分光光度计上分别测定 260nm和280n

52、m处的吸光度。根据OD260和OD280两者比值可以确定RNA的浓度 和纯度，将总RNA的浓度调整为1I-tglxl分装，置于-80"C长期保存，用于RT-PCR的扩增。543 RT-PCR检测EphB4 mRNA的表达(1)逆转录至eDNA按照下列组成配制逆转录反应液MgCl2m1 0xRT BufferRNase Free dH20蔓7dNTP MixtureRNase Inhibitor仉 2AMV Reverse Transeriptase0L m吣m蛆UOligo dT-Adaptor Primer0L样品RNATotal1 2卸卸卸卸c1n按照下列条件进行逆转录反应423

53、0min995min55min共进行1个循环 (2)PCR反应引物序列18按下列组成配制PCR反应液5xPCR Buffer10山灭菌蒸馏水2875pl瑚<状aExTaqHS0251xl上游特异性PCR引物05pl下游特异性PCR引物051xlTotal40Itl把PCR反应液加入到逆转录反应结束后的PCR管中，轻轻混匀；PCR反应：95预变性5min，然后在95变性30s、55退火15s、72 延伸30s，以上三个步骤共进行30个循环，最后720C延伸4min，将扩增产物置于-20冰箱中保存或进行2琼脂糖凝胶电泳。 55 westernblot检测EphB4基因蛋白的表达 551细胞蛋白的提取(1)转染48h后倒掉培养液，每瓶细胞加入3ml已经4预冷的PBS液(001M pH7273)，轻轻摇动lmin，洗涤细胞，倒掉废液。洗涤三次，把PBS液倒干净 后，置培养瓶于冰上；(2)lml的裂解液加lO山的PMSF(100raM)，摇匀，放在冰上； (3)每一瓶细胞加入4009l含有PMSF的裂解液，放置于冰上30min，轻轻摇动； (4)放在冰上，用干净的刮棒快速把细胞刮到培养瓶的一侧，把细胞碎片及裂解液移到EP管； (5)4"C下以12000rpm离心，5