细胞糖胺多糖GAG总含量二甲基亚甲基蓝DMMB比

1、细胞糖胺多糖（GAG ）总含量二甲基亚甲基蓝（ DMMB ）比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞糖胺多糖（GAG ）总含量二甲基亚甲基蓝（DMMB ）比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取可溶性糖胺多糖，与二甲基亚甲基蓝染料结合，在丙醇解离溶液中，释放紫红色染料 ，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种人体或动物细胞（皮肤、肌肉、软骨、肿瘤）等糖胺多糖水平检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。技术背景糖胺多糖（ glycosaminoglycan ； GAG ），又称为粘

2、多糖（mucopolysaccharide），是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖，由重复的二糖单位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（ hexuronic acid ），链接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖与核心蛋白（core protein ）共价相联，构成蛋白多糖（proteoglycan； PG），成为细胞膜和细胞外基质（extracellular matrix ； ECM ）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化（sulfated group ），其部位在 O或 N位上，有利于发挥各种不同的作用，包括酶的调节、细胞黏附

3、、生长、迁移、分化，以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点，使用异染性（metachromatic）阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝（1,9-dimethylmethylene blue ；DMMB ），在酸性条件下， 特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物（ Dye-GAG complex ），在丙醇解离溶液中，释放出染料，通过分光光度仪（656nm波长）测定，来定量分析糖胺多糖的总含量。产品内容清理液（ Reagent A）萃取液（ Reagent B）染色液（ Reagent C）解离液（ Reagent D）标准液（ Reagent E）产品说明书毫升毫升毫升毫升微

4、升1 份保存方式保存萃取液（ Reagent D）在 20冰箱里；其余的保存在4冰箱里；染色液（ Reagent C）避免光照；有效保证 6 月用户自备1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于细胞脱离恒温水槽或干式恒温仪：用于样品反应微型台式离心机：用于样品操作比色皿或酶标板：用于比色分析的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品预处理1 准备好 25cm2 细胞培养瓶或 60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1至 5X106细胞）2 小心加入 xx 毫升 清理液（ Reagent A），覆盖生长表面3 小心抽去清理液4 使用细胞

5、刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化 ）5 加入 xx 毫升 清理液（ Reagent A），混匀细胞6 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始 ）7 放进 4台式离心机离心5 分钟，速度为 300g8 小心抽去上清液9 加入 xx 微升 萃取液（ Reagent B）10放进一个 1.5 毫升离心管11强力涡旋震荡 1 分钟，充分混匀12放进 56恒温水槽孵育 16 小时13放进 90恒温水槽孵育 10 分钟14放进微型台式离心机离心10 分钟，速度为16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）15小心移取上清液到新的1.5 毫升离

6、心管16置于冰槽里备用二、标准样品配制1 准备好 5个 1.5 毫升离心管，标记为1至5号管2 分别加入 xx 微升 清理液（ Reagent A）到 1 至 5 号管3 移取 xx 微升 标准液（ Reagent E）到 1 号管，混匀4 小心移取 xx 微升 1 号管稀释的标准液（ Reagent E）到 2 号管，混匀5 小心移取 xx 微升 2 号管稀释的标准液（ Reagent E）到 3 号管，混匀6 小心移取 xx 微升 3 号管稀释的标准液（ Reagent E）到 4 号管，混匀7 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表管号清理液（ Reagent A）标准液（ Rea

7、gent E）标准糖胺多糖含量1xx 微升xx 微升xx 微克2xx 微升xx 微升 1 号管xx 微克3xx 微升xx 微升 2 号管xx 微克4xx 微升xx 微升 3 号管xx 微克5xx 微升00三、 标准曲线测定1 移取 xx 微升上述配制的标准液（ Reagent E）到 1.5 毫升离心管2 加入 xx 毫升染色液（ Reagent C）3 涡旋震荡 15 秒4 室温下孵育30 分钟，避免光照，期间每隔5 分钟涡旋震荡5 即刻放进微型台式离心机离心10 分钟，速度为16000g15 秒（注意：可见紫色或粉红色沉淀）6 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）7 加入 xx 毫升解

8、离液（ Reagent D）8 涡旋震荡 15 秒9 室温下孵育5 分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）10转移到新的比色皿11即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得标准样品吸光读数12重复实验步骤1 至 11 四次13构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为吸光读数；横座标（X 轴）为标准糖胺多糖含量（微克）四、 样品测定1 加入 50 微升上述制备的待测样品到1.5 毫升离心管2 加入 xx 毫升染色液（ Reagent C）3 涡旋震荡 15 秒4 室温下孵育30 分钟，避免光照，期间每隔5 分钟涡旋震荡5 即刻放进微型台式离心机离心10 分钟，速度为16000g15 秒（注意：可见紫色

9、或粉红色沉淀）6 小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）7 加入 xx 毫升解离液（ Reagent D）8 涡旋震荡 15 秒9 室温下孵育5 分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）10转移到新的比色皿11即刻放进分光光度仪检测（波长656nm）：获得样品吸光读数12根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量（微克）五、 浓度计算注意事项1 本产品为25 次操作，包括标准样品2 本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸（hyaluronate）的检测3 本产品可以检测硫酸软骨素（ chondroitin sulfate ）、硫酸角质素 （keratan sulfate）、硫酸皮肤素 （dermatansulfate）、硫酸类肝素（heparan sulfate）等主要糖胺多糖4 本产品检测范围为0.2 至 5 微克糖胺多糖5 操作时，须戴手套6 系统操作时，标准样品测定只需1 次7 空白对照读数通常小