紫外可见分光光度法

1、动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称吸光光吸光光度法度法，它包括比色法和分光光度法。，它包括比色法和分光光度法。 紫外紫外-可见分光光度法是研究物质在紫外、可见光区的可见分光光度法是研究物质在紫外、可见光区的分子吸分子吸收光谱收光谱的分析方法。它属于分子光谱法的一种，是利用某些物的分析方法。它属于分子光谱法的一种，是利用某些物质的分子吸收质的分子吸收200800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法光谱区的辐射来进行分析测定的方法。 这种分子吸收光谱产生于这种分子吸收光谱产生于价

2、电子价电子和分子轨道上的电子在电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性、定量测定。能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性、定量测定。概述动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 当一束太阳光照射某一溶液时，太阳光中某一颜色的光当一束太阳光照射某一溶液时，太阳光中某一颜色的光被吸收，其被吸收，其互补色光互补色光透过溶液，刺激人的眼睛，使人感觉到透过溶液，刺激人的眼睛，使人感觉到它的颜色。它的颜色。溶液颜色与光吸收的关系溶液颜色与光吸收的关系可见光波长及其互补光可见光波长及其互补光实例：实例：1)高锰酸钾吸收高锰酸钾吸收绿光绿光显紫显紫 红色；

3、红色；2)重铬酸钾吸收重铬酸钾吸收蓝光蓝光显黄显黄色；色；3)邻菲罗啉铁溶液吸收邻菲罗啉铁溶液吸收蓝蓝绿光绿光显红色。显红色。概述完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 /nm颜色颜色互补色互补色400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿 根据溶液的颜色，可以估计该溶液吸收的光的波长。根据溶液的

4、颜色，可以估计该溶液吸收的光的波长。概述动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 分光光度法在发展过程中先后经过了分光光度法在发展过程中先后经过了目视比色法，光电比色法目视比色法，光电比色法和分光光度法和分光光度法三个阶段。三个阶段。（1）目视比色法目视比色法是一种用眼睛辨别颜色深浅，以确定待测组分是一种用眼睛辨别颜色深浅，以确定待测组分含量的方法。含量的方法。 （2）光电比色法光电比色法是使用光电比色计测量溶液吸光度并计算待测是使用光电比色计测量溶液吸光度并计算待测组分含量。组分含量。 （3）分光光度法分光光度法是应用分光光度计，通过测定被测物质在特定是应用分光光度计，通

5、过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度，对该物质进行定性、定波长处或一定波长范围内光的吸光度，对该物质进行定性、定量分析的方法。它包括紫外分光光度法、可见光分光光度法、量分析的方法。它包括紫外分光光度法、可见光分光光度法、红外分光光度法等。红外分光光度法等。 分光光度法的发展过程概述动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(即吸光度即吸光度A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为一条曲线，称为吸收光谱曲线吸收光谱曲线(简

6、称吸收曲线简称吸收曲线)。吸收光谱示意图吸收光谱示意图概述动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 透过光的强度透过光的强度 It与入射光的强度与入射光的强度I0之比称为透光度，之比称为透光度，用用 T表示。常用表示。常用百分数百分数表示：表示：T = It / I0 为了表示物质对光的吸收程度，常采用吸光度为了表示物质对光的吸收程度，常采用吸光度A这这一概念，即透光度倒数的对数值。一概念，即透光度倒数的对数值。A = lg（I0 / It）= lg（1 / T）= lg T 朗伯比耳定律2022-2-1681.透光度透光度T 和吸光度和吸光度A 动物检疫检验技术专业教学资

7、源库动物检疫检验技术专业教学资源库2.2.朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格( (BouguerBouguer) )和朗伯和朗伯( (Lambert)Lambert)先后于先后于17291729年和年和17601760年阐明年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。 Ab 1852年比耳年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。也具有类似的关系。 Ac 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律，其数学表达式为：比耳定律，其数学表达式为： A = b c 朗伯朗伯比耳定律是吸光光度法的理论基础和

8、定量测比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。定的依据。动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 朗伯朗伯比耳定律适用于比耳定律适用于 1. 1.使用使用单色光单色光为入射光；为入射光； 2. 2.溶液溶液均匀均匀，非散射光；，非散射光； 3. 3.溶液为溶液为稀稀溶液。溶液。 在实际工作中经常发现标准曲线不成直线的情况，特别是当在实际工作中经常发现标准曲线不成直线的情况，特别是当吸光物质的浓度高时。吸光物质的浓度高时。 光吸收定律的适用范围2022-2-1610AC紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示系统显示系统0.

9、575光源光源单色单色器器吸收池吸收池检测器检测器显显示示动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库1. 1. 光源光源作用作用-提供入射光提供入射光 在整个紫外光区或可见光谱在整个紫外光区或可见光谱区区可以发射可以发射连续光谱连续光谱，具，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：可见光区：钨灯钨灯作为光源，作为光源，其辐射波长范围在其辐射波长范围在3202500 nm。 紫外区：紫外区：氢、氘灯氢、氘灯，发射，发射200375 nm的连续光谱。的连续光谱。紫外分光管度计构成动物检疫检验技术专业教学资源库动物

10、检疫检验技术专业教学资源库 2.2.单色器单色器 作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光单色光。 入射狭缝：入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；棱镜或光栅； 聚焦装置：聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝出射狭缝。紫外分光管度计构成动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库3.3.样品室样品室 样品室放置各种类型的吸收池样品室放置各种类型的吸收池（比色皿

11、）和相应的池架附件。（比色皿）和相应的池架附件。 在紫外区须采用在紫外区须采用石英池石英池，可见区一般用，可见区一般用玻璃池玻璃池。 注意：注意：用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿应用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿应互相匹配互相匹配，即有相同的，即有相同的厚度厚度与相同的与相同的透光性透光性。为了减少反射损。为了减少反射损失，比色皿的光学面必须完全失，比色皿的光学面必须完全垂直垂直于光束方向。于光束方向。 不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要及时洗涤及时洗涤，可用，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过温水或稀盐酸，乙醇以至

12、铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过1515分分钟），表面只能用钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸柔软的绒布或拭镜头纸擦净。擦净。 紫外分光光度计构成动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库4.4.检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的光信号变成可测的电信号，常用的有有光电池、光电管或光电倍增管光电池、光电管或光电倍增管。5.5.显示系统显示系统 检流计、数字显示、计算机进检流计、数字显示、计算机进行仪器自动控制和结果处理。行仪器自动控制和结果处理。紫外分光光度计构成动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资

13、源库紫外可见分光光度计的类型紫外可见分光光度计的类型 按光路结构可分为：按光路结构可分为：1.单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计2.单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计3.双波长双光束分光光度计双波长双光束分光光度计 动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 1.1.预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min20min，为了防，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比色皿暗箱盖打止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。开，使光路切断

14、。 2.2.选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。光波长。 3.3.固定灵敏度档。旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再固定灵敏度档。旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在变动。一般测量固定在“1 1”档。档。 4.4.调节调节“0 0”点。轻轻旋动调点。轻轻旋动调“0 0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0 0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断

15、，光电管不受光照）。 5.5.调调“0 0”和调和调“100100”。比色皿中装入参比溶液近。比色皿中装入参比溶液近4/5,4/5,放入比色皿座架的第一放入比色皿座架的第一格内，其它格内放入样品或标样，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，用参比溶格内，其它格内放入样品或标样，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，用参比溶液重复调液重复调“0 0”和和“100%100%”, ,至仪器稳定。至仪器稳定。 6.6.测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使样品或标样溶液进入光路，此时表测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使样品或标样溶液进入光路，此时表头指针所示为该溶液的吸光度头指针所示为该溶液的吸光度A A。读数后，打开比色皿暗箱盖。

16、读数后，打开比色皿暗箱盖。 7.7.关机。实验完毕，整理仪器，切断电源。将比色皿取出洗净，并将比色关机。实验完毕，整理仪器，切断电源。将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。皿座架及暗箱用软纸擦净。分光光度计操作步骤分光光度计操作步骤动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库2022-2-1618p 对仪器工作环境的要求对仪器工作环境的要求 稳固的工作台稳固的工作台 温度、湿度合适温度、湿度合适 p 仪器保养和维护方法仪器保养和维护方法 仪器工作电源仪器工作电源 光源使用注意事项光源使用注意事项 单色器使用注意事项单色器使用注意事项 正确使用吸收池正确使用吸收池紫外

17、分光光度计使用注意事项动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库2022-2-16比色皿的使用比色皿的使用(1)要根据所使用的波长来选择比色皿。要根据所使用的波长来选择比色皿。 石英比色皿和普通硅酸盐玻璃比色皿两种。石英比色皿和普通硅酸盐玻璃比色皿两种。 (2)选择配对良好的比色皿。选择配对良好的比色皿。 根据国家检定规程的要求比色皿间的偏差不得超过根据国家检定规程的要求比色皿间的偏差不得超过0.5%，所，所以比色皿在使用之前，要对比色皿进行透光测定，把偏差小于以比色皿在使用之前，要对比色皿进行透光测定，把偏差小于0.5%的比色皿配对使用。的比色皿配对使用。(3)选择合适厚度

18、的比色皿。选择合适厚度的比色皿。 常用比色皿厚度有常用比色皿厚度有1、2、3、5、10cm等，在实际分析工作中，等，在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在光度控制在0.20.7之间。之间。(4)对有挥发性的样品，选择带盖比色皿。对有挥发性的样品，选择带盖比色皿。1. 比色皿的选择比色皿的选择动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库(1)拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

19、光面，以免沾污。(2)不得将光学面与硬物或脏物接触。不得将光学面与硬物或脏物接触。(3)测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液润洗比色皿内壁几次，测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液润洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。(4)盛装溶液时，高度为比色皿的盛装溶液时，高度为比色皿的4/5处即可。处即可。(5)比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透

20、光面。(6)凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。(7)不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤。不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤。2. 比色皿的使用方法比色皿的使用比色皿的使用动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库 (1)每次做完实验时，应立即洗净比色皿。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。 清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。 如比色皿被有机物沾污，可用盐酸如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（乙醇混合洗涤液（1

21、:2）浸）浸泡片刻，再用水冲洗。泡片刻，再用水冲洗。 不能用碱溶液或铬酸洗液等氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免不能用碱溶液或铬酸洗液等氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。损坏。 (2)不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。3. 比色皿的清洗比色皿的使用比色皿的使用动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库1. 干扰干扰(1)与试剂生成有色配合物。如用钼蓝法测定硅时，与试剂生成有色配合物。如用钼蓝法测定硅时，磷也能生成磷钼蓝，使测定结果偏高。磷也能生成磷钼蓝，使测定结果偏高。(2)干扰离子本身有颜色。干扰离子本身有颜色。(3)与试剂反

22、应，生成的配合物虽然无色，但要消耗与试剂反应，生成的配合物虽然无色，但要消耗大量显色剂，使被测离子的显色反应不完全。大量显色剂，使被测离子的显色反应不完全。(4)与被测离子结合成离解度小的另一种化合物。使与被测离子结合成离解度小的另一种化合物。使被测离子与显色剂不反应。被测离子与显色剂不反应。共存离子的干扰及消除方法共存离子的干扰及消除方法2022-2-1622动物检疫检验技术专业教学资源库动物检疫检验技术专业教学资源库（1 1）控制酸度提高反应的选择性，保证主反应进行完全，以避免干扰。）控制酸度提高反应的选择性，保证主反应进行完全，以避免干扰。（2 2）加入掩蔽剂）加入掩蔽剂 选择掩蔽剂的原

23、则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。（与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。（3 3）选择适当的参比溶液）选择适当的参比溶液（4 4）选择适当的波长）选择适当的波长（5 5）利用氧化还原反应改变干扰离子的价态，使干扰离子不与显色剂反应利用氧化还原反应改变干扰离子的价态，使干扰离子不与显色剂反应。例例如用铬天菁如用铬天菁S S光度法测定光度法测定AlAl3+3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将FeFe3+3+还原为还原为FeFe2+2+，消除消除FeFe3+3+的干扰。