DGGE微生物工程

1、 综述题目：DGGE/TGGE技术的原理及应用DGGE/TGGE技术的原理及应用摘要DGGE技术最先由Fischer和Lerman于1979年提出，是用于检测DNA突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。随后发展为其衍生技术TGGE。这两种技术在研究微生物类群的多样性、环境中微生物变化的动态监测、发现新的微生物、功能基因多样性的研究中重要的贡献。文章对DGGE/TGGE技术原理与操作过程、在生态学中的应用以及它的优、缺点进行了综述。关键词: 变性梯度凝胶电泳; 温度梯度凝胶电泳;原理；操作过程；应用；缺陷及优化AbstractDen

2、aturing temperature gradient gelelectrophoresis(DGGE)was first put forward by Fischer and Lerman in 1979.This technology is used to detect mutation of the gene and its distinguishability is higher than agarose gel electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE).Later it develop to a tec

3、hnology called TGGE.These two technologies is very importance in the studies of microbial diversity ,dynamic monitoring of the change in environment microbial and detect new microbial.This review summarizes the theory and operating procedure in DGGE and TGGE and introduces its application ,its defec

4、ts and how to optimize the procedure.Key Words: Denaturing temperature gradient gelelectrophoresis ; temperaturegradient gelelectrophoresis ; the theory;operating procedure ; application;defects and optimize1.1 变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳基本原理 1.11发展历史DGGE技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂

5、糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。Muyzer1 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gelelectrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。1.12基本原理双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TG

6、GE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。一个几百个碱基对的 DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域

7、也发生解链，从而双链 DNA 完全解链。不同的双链 DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦 DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链时，双链 DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的 DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链

8、温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。1.13操作过程该技术主要包括以下步骤:样品的采集;样品总DNA提取及纯化;样品16S rDNA片段的PCR扩增;预实验(主要是对扩增出的16S rDNA片段的解链性质及所需的化学变性剂浓度范围或温度梯度范围进行分析);制胶;样品DGGE/TGGE分析。1.2 DGGE系统优化温度（或变性剂浓度）达到 DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链 DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。1985年M

9、uzyers等2首次在DGGE中使用“GC夹”(30-50个碱基对)可以解决这个问题。含有GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止 DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR扩增技术，用 PCR 扩增的 16S rRNA 产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的 5-端含有一段 GC 夹子，用来扩增微生物群落基因组总 DNA，扩增

10、产物用于DGGE/TGGE 分析。DGGE/TGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的 PCR 扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围或温度范围。垂直电泳时，胶从左到右是变性剂梯度或温度梯度。在胶的左边，变性剂浓度或温度低，DNA 片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高，DNA 一进入胶立刻就发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA 片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于DNA 片段最低的解链区域时，DNA 的迁移速率有急剧的

11、变化。因此，DNA 片段在垂直胶中染色后呈 S 形的曲线，根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析不同的样品。在用水平电泳分析样品之前，先要优化确定电泳所需时间。一般采用时间间歇的方法，即每隔一定时间加一次样品，从而使样品的电泳时间有一个梯度，根据这个结果，确定最佳的电泳时间。通过各种染色方法可以看到DGGE/TGGE 胶中的 DNA 条带。最常用的几种染色方法是溴化乙啶，SYBR GreenI, SYBR Gold 和银染法。EB 法染色的灵敏度最低。SYBR Green I 和 SYBR Gold 相比 EB，能更好地消除染色背景，因此它们的检测灵敏度比 EB 法高很多。EB 和 S

12、YBR 染色时，双链 DNA 能很好地显色，单链 DNA 基本上不能显色。银染法的灵敏度最高，它不但能染双链 DNA，也能染单链 DNA，但它的缺点是不能用于随后的杂交分析。1.3 DGGE在微生物生态中的应用1.3.1研究微生物类群的多样性从环境样品直接提取总DNA,经PCR扩增得到含有某一高变区的目的DNA序列产物,通过DGGE得到带谱。因为每个条带很可能就代表一个不同的微生物物种,所以DGGE带谱中条带的数量,即反映出该环境微生物群落中优势类群的数量。但为了得到更详实的信息,往往采用种或类群专一性探针与得到的条带进行杂交或将条带切下,重新扩增后测序,进而得到部分系统发育信息。Muyzer

13、1首次应用DGGE研究了菌藻席和细菌生物膜中微生物的遗传多样性。在得到DGGE带谱后,将其印迹转移到尼龙膜上与硫还原细菌特异性探针进行杂交,与其中一样品的带谱出现了强烈的杂交信号,表明该环境中存在硫还原细菌。1.3.2用于环境中微生物变化的动态监测DGGE技术的一个显著特性就是可以同时对多份样品进行分析,因此适合于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化。Duineveld3应用DGGE研究了菊花生长过程中其根际细菌类群多样性的动态变化,发现生长过程中根际细菌类群的DGGE带谱通过UPGMA算法聚类分析,带谱之间的相似性为82%,没有发生显著变化,与同时通过纯培养方法进行研究的结果一致,因此认

14、为根的生长过程对根际优势细菌类群的影响不大。Smit4等也应用DGGE对一麦田中优势细菌的多样性随季节的变化做了研究,结果显示不同季节样品的DGGE带谱有差异,但差异仅出现在较弱的条带上,表明麦田中的优势细菌相对稳定,但在较弱条带所代表的细菌类群上存在着较大差异。通过对带谱进行聚类分析,发现虽然其中的优势细菌类群相对稳定,但七月份的带谱与其它月份的明显不同,表明七月份麦田中的细菌多样性发生了某些变化。这一结果与通过纯培养得到的结果相同,虽然这两种方法可能探测到完全不同的细菌类群。1.3.3有助于发现新的微生物目前,自然界中可获得纯培养的微生物仅占1%-15%,这些微生物只是易于在人工的营养条件

15、及培养条件下形成克隆,并不一定是天然的优势菌群,而分子生物技术又通常只能检测到优势菌的存在,因此自然界中还有很大一部分微生物尚未被发现。应用DGGE与富集培养相结合有助于发现这一部分微生物。Santegoeds5等对美国黄石公园一温泉中的菌藻系进行了不同的富集培养,通过DGGE检测到了以往利用纯培养及分子技术均没有发现的10个好氧化能合成细菌类群基因。通过对DGGE条带测序得到的遗传信息并结合已知的生理生化知识有助于发现新的微生物物种,并分离得到纯培养。Teske6就成功地应用该方法从一菌藻系共生体中分离纯化得到了两个纯的菌种。1.3.4对功能基因多样性的研究微生物多样性及其生理代谢活动在生态

16、系统的物质循环和能量循环中起着重要的作用,是微生物生态研究的主要内容之一。对环境样品总DNA的直接检测能够从基因水平上反映出该环境中微生物的多样性状况,这其中包括了代谢旺盛的、休眠或无代谢活性的微生物,不能单独反映该环境中有代谢活力的微生物的状况。代谢旺盛的细胞中具有较多的核糖体,因此可以通过对mRNA的研究来反映环境中处于不同生理代谢活动期的微生物。NiFe氢化酶在Desulfovibrio菌株的能量代谢中起着重要的作用,通过对6株菌的研究表明,在指数生长期时才可以检测到NiFe氢化酶mRNA的存在,而在稳定期时则检测不到。因此,可以将它的有无作为检测这些细菌代谢活性时相的一个标准。Wawe

17、r7等通过PCR-DGGE对不同环境下的生物反应器中Desulfovibrio菌株的NiFe氢化酶大亚基基因进行了研究。分别提取出总DNA及RNA,进行PCR和RT-PCR得到目的基因,通过DGGE分析并对得到的条带进行测序,结果表现出丰富的基因多样性,并且表明NiFe氢化酶基因的转录与细菌在生长周期所处的时相密切相关,这一结果与用纯菌株的研究结果相同。该研究提示可以通过DGGE对环境中的功能基因多样性进行研究。1.4 DGGE/TGGE 技术的缺陷在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体 RNA拷贝数不同；提取基因组总 DNA 时细胞的裂解效率不同

18、；DNA 提取和纯化时有偏差；PCR 扩增过程中有偏差。除了这些，在应用DGGE/TGGE 技术分析微生物群落结构组成时还有很多其他的缺陷。DGGE/TGGE 一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段，因此得到的系统进化相关的信息就很少。在研究复杂环境生态系统（如土壤，人体肠道）时，其中微生物种类很多。但DGGE/TGGE 图谱中一般只有一二十个条带，这些条带反映的是群落中的优势菌群。一般只有在总的微生物群落中占 1%以上的种群才能被检测出来，系统中的弱势菌群不能被检测到。为了降低分析群落多样性时的复杂度，一种方法是先根据 GC 含量的不同，将基因组总 DNA 分成各个部分，再分别

19、PCR-DGGE/TGGE 分析。另一个方法是使用类群特异性（group-specific）引物对基因组总 DNA 进行 PCR 扩增，再用于DGGE/TGGE 分析。在设计 PCR 引物去扩增某些特定菌群时，由于某些菌群的序列相互之间同源性不是很高，因此需要设计简并性引物。此时，相同的微生物会有 2 个条带，这会对微生物群落结构组成造成高估。另外，同一个细菌也可以有多个核糖体 RNA 操纵单元，它们的序列可以有微小差异，这也会高估微生物群落多样性。DGGE的电泳条件不一样，即使相同的样品所得的图谱也会有差异。在应用DGGE 时，如果所用电压太低，需要的电泳时间就很长，变性剂梯度会有变化，因此

20、导致图谱也会有变动。另外，DGGE/TGGE 的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究，得到它们的序列，从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信息。以前研究DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构建整个微生物群落的16SrRNA 克隆文库，然后再对文库中的克隆进行扩增，通过DGGE/TGGE 和原始样品的条带进行对比，能迁移到相同位置处的克隆的序列就是原始条带所含的序列。然而，已有研究表明，不同的 DNA 条带在DGGE/TGGE 胶中可以迁移到相同的位置，因此单一DGGE/TGGE 条带可能含有不止一种序列。这种情形在分析复杂环境样品时会

21、更多。另一个研究DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的方法是直接从胶中回收DNA，然后构建其克隆文库，再对其中的克隆进行测序。现在越来越多的研究人员采用后一种方法。然而，PCR 过程中产生的异源双链（heteroduplex）和单链 DNA（single-stranded DNA）也会对分析单一条带序列造成偏差。人们已经普遍意识到异源双链 DNA 会在DGGE/TGGE 胶中产生虚假条带，然而对单链 DNA 造成的偏差还没有引起足够的重视。我们实验室以某处理工业焦化废水的活性污泥为研究对象，详细地分析了单链 DNA 在分析TGGE 胶中单一条带序列组成时所造成的影响，发现它会大大高估单一条

22、带中的序列多样性。另外，我们还对比了3种去除单链 DNA 的方法，发现变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的效果最好。我们建议在进行DGGE/TGGE 电泳之前，尤其是要分析单一条带序列时，要先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR 产物进行纯化，然后再走电泳。1.5 展望尽管DGGE/TGGE技术具有以上局限性,但其重现性强、可靠性高、速度快、能够弥补传统方法分析微生物群落的不足,已成为现代微生物学领域一种重要研究手段。在国内DGGE/TGGE技术在微生物分子生态学研究中的应用还处于起步阶段,借助于标记基因的PCR扩增技术以及rRNA和mRNA为靶序列,DGGE/TGGE技术能够再现微生物群落多样性,获得微

23、生物在时间和空间上的动态信息。由分子生物技术所测得的微生物种类及其数目可用于建立更完整的微生物种群动力学模式,可提高污染物处理的稳定性及提供处理效率不佳时的解决方法。因此,充分了解DGGE/TGGE技术的基础背景和局限性,结合其他分子生物学技术是诊断和评价复杂微生物群落的种群结构及其动态学最有前景的技术手段。参考文献1 Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial population by DGGE analysisof polymerase chain reaction amplifi

24、ed genes encoding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol.62:2676-26802 Myers RM, Fischer S G, LermanLS,et al. Nearly all single base substitutions in DNAfragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturinggradient gel electrophoresis.NucleicAcids Res, 1985,13:3131-3145.3 Duineveld B M,Rosado

25、A,Elsas J D,et al.Analysis of the dynamics of bacterial communities in the rhizophere of the chrysanthemum via denaturing gradientgel electrophoresis and substrate utilization patternsJ.Appl Environ Microbiol,1998,64(12):4950-4957.4 Smit E,Leeflang P,Gommans S,et al.Diversity and seasonal fluctuations of the dominant membe