崔志钢的论文

1、基因枪介导GmDREB3基因转化小麦幼胚愈伤组织的研究崔志钢1,陈耀锋1,周文丽1,杨梅1,徐东北1（1 西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100）摘要 为了提高小麦的抗逆性，本实验通过基因枪共转化途径，将GmDREB3基因和抗除草剂bar基因通过共转化途径同时导入小麦品种小偃22。实验结果表明小麦幼胚通过9天的愈伤组织诱导，基因枪轰击金粉用量为60g/枪，分别添加NAA和KT 1mg/L的MS培养基，这一组合获得抗性再生植株频率最高。并对再生植株进行PCR检测表明，目的基因已整合到小麦染色体组。关键词 基因枪;愈伤组织;恢复培养;筛选分化;再生植株中图分类号 文献标识码 A 文章编

2、号 Studies of transformation of the GmDREB3 gene into Immature Embryos of Wheat by Particle BombardmentCUI Zhigang ,CHEN YaoFeng,ZHOU WenLi,YANG Mei,XU DongBei( 1 College of Agronomy , Northwest A&F University , Yangl ing , Shaanxi 712100, China)Abstract: Key words: gene gun；callus；recovery cultu

3、re；screening and differentiation；regeneration plant小麦转基因研究始于20世纪90年代初期，近些年来，大量有关转基因科研工作的开展，使小麦转基因有了迅速的发展。但由于小麦转化研究起步较晚，普遍存在转化频率低的现象。转化系统还有待进一步完善，因此有必要对转化过程中的诸多影响因素进行研究。从而提高小麦转化频率，加快转基因小麦的应用与产业化进程。本研究对基因枪法转化小麦中的愈伤组织诱导时间，金粉用量，筛选分化培养基等影响因素进行了研究，为完善小麦转化系统提供一定的依据。1 材料和方法1.1 实验材料及培养基1.1.1 受体材料以小麦幼胚愈伤组织为基因

4、枪轰击的受体材料。小麦材料为西北农林科技大学细胞工程实验室试验田种植的黄淮麦区优良小麦品种(系) 小偃22。1.1.2 载体和引物携带GmDREB3基因的植物表达载体质粒为pKS,携带筛选标记抗除草剂（bar）基因的质粒载体为PAHC20,由北京农科院马有志老师提供。设计的特异引物由上海生物工程技术服务有限公司合成,序列如下:5引物CAGAGGAGCATAGCGATTCCAAGTA3引物TCCCGTAATCGGATGCGTAACCACT1.1.3培养基愈伤诱导培养基: MS + 2 , 4-D 2. 0mg/ L + 蔗糖30 g/ L + Ag5. 0 g/ L(p H5. 8) ;高渗培养

5、基:MS + 山梨醇0.2mol/L+ 甘露醇0.2mol/L + Ag 6. 0 g/ L (p H 5. 8) ;恢复培养基: SD2 + 2 , 42D 2. 0 mg/ L + 蔗糖30 g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8) ;筛选分化培养基: MS+NAA0.1mg/L+KT1mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；1/2MS+NAA0.5mg/L+KT1.0mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；MS+NAA0.1mg/L

6、+KT3mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；1/2MS+KT1.0 mg/L +NAA1.0mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L+ Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)；MS+KT1mg/L+Bialaphos 2mg/L+蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/ L (p H5. 8)。生根培养基：1/2MS+NAA0.5mg/L+Bialaphos2mg/L+多效唑4mg/L+蔗糖30g/L+Ag 6. 0g/ L (p H5.8)；壮苗培养基：1/2MS+Bialaphos 2mg/

7、L+多效唑4 mg/L +蔗糖30g/ L + Ag 6. 0 g/所有培养基均采用高温高压灭菌,筛选剂采用过滤灭菌,培养基冷却至50-60 左右时加入。1. 2 方法1. 2. 1 幼胚愈伤组织诱导于田间剪取授粉14左右的麦穗，剥取幼嫩种子，于超净工作台内用体积分数75 %的酒精表面消毒30 s ,再用1 g/ L的升汞灭菌810 min ,灭菌过程中不停的摇动麦粒，无菌水冲洗5次,剥取幼胚,平面向上接种到幼胚愈伤组织诱导培养基上,26下黑暗培养,诱导时间分别为：3d，6d，9d，12d。1. 2. 2 高渗处理小麦愈伤组织在直径9 cm 的培养皿上铺一薄层高渗培养基,将幼胚愈伤组织按原生长

8、方向紧密摆放于培养皿中央直径3 cm 范围之内，在轰击前6 h对幼胚愈伤组织进行高渗处理。 1. 2. 3基因枪转化采用PDS-1000/He基因枪（bia-rod公司生产）轰击小麦幼胚诱导的愈伤组织。基因枪轰击压力为1100 p si ,真空度为3 733 Pa ,金粉直径为1. 0 m ,轰击距离为9 cm ,每枪金粉用量分别为30g、60g、120g ，质粒DNA用量为1.0g 。轰击后轰击后16-18 h在原高渗培养基上对幼胚愈伤组织进行高渗处理。高渗处理后将愈伤组织转移至恢复培养基上进行14 d 的暗恢复培养。1. 2. 4筛选分化对恢复14d 后的愈伤组织用5种不同筛选分化培养基附

9、加2mg/LBialaphos进行再生筛选，在24光照10h条件下筛选分化培养6-7周。1. 2. 5 生根壮苗待到愈伤组织分化出绿芽以后，将分化的绿芽转入附加4mg/L多效唑的生根培养基上直到小苗伸长（光照与温度同前），待到小苗伸长到4-5cm时，移入壮苗培养基上壮苗，再生植株生长到适宜大小（苗高6-8cm，根系较好）时移入培养钵中，在15左右光照培养，待苗壮后置于温室。 1. 2. 6转化植株的PCR 检测对筛选得到的抗性再生植株,用CTAB 法提取叶片基因组DNA 进行PCR 检测,以携带目的基因的质粒为阳性对照,以未进行转化的植株DNA为阴性对照,扩增条件为:94 5 min ;94

10、45 s ,58 45 s , 72 90 s ,35 个循环;72 延伸10 min。经PCR 扩增后,将扩增产物在10 g/ L琼脂糖凝胶上进行电泳检测并照相。2结果与分析2.1小麦幼胚愈伤组织诱导时间对基因枪轰击后植株再生率有显著影响在其他条件相同的情况下，随着愈伤组织诱导天数的增加，再生植株率明显升高，但诱导时间增加到12天，再生植株率略有下降。在高渗透处理前,小麦幼胚愈伤组织的生长状态和生理状态直接影响着基因枪转化效率的高低,不能或者难以启动再分化的愈伤组织不宜作为基因枪转化的受体。本研究表明（表1）,经过9天的诱导的小麦幼胚愈伤组织最佳状态，其状态为黄豆大小、略呈淡黄色、结构致密（

11、图1）。此时的愈伤组织生理活性高,再生能力强,较为容易接受和整合外源基因 。同时,这类愈伤组织受轰击后恢复能力较强,再生并分化成完整植株的几率高。而呈白色或青白色、透明水浸状且质地松软的愈伤组织（图2）,由于其本身生理活性较低,在接受基因枪轰击后,细胞受损更加严重,难以恢复,生长增殖也受到抑制,目的基因几乎不能整合并通过植株再生得以表达。2.2不同金粉用量对基因枪轰击后植株再生频率的影响表2表明，在其他条件相同的情况下，基因枪轰击时金粉用量为60g/枪，再生植株率较高。基因枪轰击幼胚愈伤组织金粉用量过大将会给愈伤组织带来不可逆转的损伤，使愈伤组织很难或者失去分化为再生植株的能力。而过低的金粉用

12、量会间接的降低外源DNA的用量，从而降低基因枪转化效率。2.3 筛选分化培养基类型以及添加激素的量对基因枪轰击后植株再生频率的影响表3在基因枪轰击转化实验中,从经渗透处理和恢复培养后得到的植株的再生频率还可以看出（表3）,在同一诱导时间, 同一金粉用量，使用筛选分化培养基MS+NAA1mg/L+KT1mg/L+Bialaphos 2mg/L的分化频率高于其它四个培养基。 图1 图2 Fig.1 Fig.2 表1 幼胚愈伤组织诱导时间对再生植株率的影响Table 1 Young embryo callus induction time of regenerative plants rate in

13、fluence诱导时间（天）愈伤组织块数（块）再生植株（株）植株再生率（%）330200630531.09306134.241230182.66表2金粉用量对基因枪轰击后植株再生频率的影响Table 2 Gold content on the gene gun bombardment after plantlet regeneration frequency influence金粉用量（g）愈伤组织块数（块）再生植株（株）植株再生率（%）3036261.6660385153.9012035141.14表3筛选分化培养基及添加激素的量对植株再生频率的影响Table 3 Screening dif

14、ferentiation media and the adding hormone amount of plantlet regeneration frequency influence筛选分化培养基愈伤组织块数（块）再生植株（株）植株再生率（%）191380.99287691.033896121.34 4888333.72 5896202.232. 4 转化植株的PCR 检测对*株经移栽成活且长势良好的再生苗的PCR 检测结果表明, *株苗均在450 bp 处有1 条与质粒DNA 扩增产物一致的特异带,而对照植株未能扩增出基因片段。初步表明目的基因已经整合到小麦基因组中。转化植株的PCR 检

15、测结果（图3）3 讨论基因枪法介导的基因转化，在禾谷类作物上应用比较广泛。遗传转化成功的关键包括建立具有高频再生能力的受体系统和优化转化条件。影响基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织的影响因素有多种。在影响基因枪转化的因素中，愈伤组织诱导时间、金粉用量以及筛选分化培养基成分是影响转化频率的关键因素。随着愈伤组织诱导天数的增加，再生植株率明显升高，但诱导时间增加到12天，再生植株率有所下降。在高渗透处理前,小麦幼胚愈伤组织的生长状态和生理状态直接影响着基因枪转化效率的高低,不能或者难以启动再分化的愈伤组织不宜作为基因枪转化的受体。经过9天的诱导的小麦幼胚愈伤组织最佳状态，其状态为黄豆大小、略呈淡黄色、结

16、构致密。此时的愈伤组织生理活性高,再生能力强,较为容易接受和整合外源基因 。同时,这类愈伤组织受轰击后恢复能力较强,再生并分化成完整植株的几率高。金粉颗粒越多，轰击对细胞造成的损伤程度越大，使受损的细胞不能恢复或恢复速度很慢，从而降低转化率。然而过低的金粉用量，又会使外源DNA的量降低，从而降低外源基因整合频率。在基因枪轰击转化实验中,从经渗透处理和恢复培养后得到的植株的再生频率还可以看出,同一诱导时间,分别添加NAA1毫克和KT 1毫克的MS培养基分化频率最高。因此，本研究通过大量的实验研究证实：小麦幼胚通过9天的愈伤组织诱导，基因枪轰击金粉用量为60g/枪，分别添加NAA和KT 1mg的MS培养基，这一组合获得抗性再生植株频率最高。基因枪转化的当代植株多为嵌合体，这在许多植物上均有表现，是一个普