第三章蛋白质及酶工程.

1、第三章蛋白质及酶工程本章主要内容:第一节第二节 基因诱变技术 第三节蛋白质的改造第一节概述2丄1蛋白质基础妾白质的一级结构:是以肽处为主钱豉有 少量m披为別拔的多狀链，显示欽基酸 种矣和膜序的钱柱分子參白质的二级结构：这是在一级姑构的衣 仙卜.借負峨点和邻两&之间的 引力使分子结构发生折韵的结构 a -螺戦(a - helix) P 折叠(P -pleated sheet)妥白质的三级结构:在二圾站构的基卅上由 氨基酸残基翎链相互作朋而侥多肽链 进一步盘録折叠形成特定的三维构 象.參与维系结构的有氨健、离子 «、统水钱等.蛋白质的四坂结构:由两条戎两無 以上多砂健姐成的妥白质

2、，每个盘立馱 链的三圾知构称为亚单位，几个亚草位 之问通过氢仗#化学钱引力相互作 用形成更为复杂的空间结构，称为四 圾妹构.Alpha HelixPleated SheetQ第一节概述 2. 1. 2蛋白质工程的概念蛋白质工程(Protein Engineering) 是在对 蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行理化及生物分 析的基础上，釆用基因工程技术对蛋白质进行修饰、 改造以提升其功能效率，甚至创造出新的功能蛋白质蛋白质氨基酸序列的分析目的蛋白质蛋白质晶体结构分析 蛋白质功能预测和分析蛋白质组分析目的基因分子设计与结 构预测功能检测改造蛋白质 的表达改造目的基因目的产品结构分析：X-射线晶体

3、衍射技术核磁共振（NMR ）蛋白质结构预测与分子设计：根据未知蛋白质氨基酸一级结构序列分析，利用计算机信息技术，比较同源蛋白质的结构，按分子动 力学、分子力学原理和算法，建立蛋白质的立体模型 ,并依据结构与功能关系研究成果，对蛋白质分子进 行合理化改进设计.蛋白质的分子量及等电点用DNA Tool 5. 1 软件分析了 Elymus sibiricus ATPase a亚基的分子量和等电点，推测蛋白质的分 子量为55.5 kDa,等电点为6. 22.蛋白质的疏水区预测ATPase a业肚N瑞和（：端仃较强的亲水件°Predicted hydrophilicity plot of th

4、e deduced amino acid sequence of a subunit of ATPase蛋白质的修饰位点分诂ATPSse,；413 416城胺R.XGRKRK）/列门激師鑛酸化位点（PKC）. 1个 酪蛋门激酚II的鏑敞化位点（CK2）和6个N曲酰化位点 十（MYRISTYL） ift明其很容易受到参种E3子的调PSOOOO5PKC PHOSPHO SITE Protein kinase C phosphorylation site :3-5:T±R92 94:TgR139 - 141:SrR174 176：TciK478 480: psccccaSsKMVRIS&g

5、t;TVI A/- m ur/<s tn win tifyn62 67：GIcllNL200 205:GQr<aSS243 - 248:GAQ 丄 AE312 317:GSmtAL353 358:GlrpAI361 366：OT8VSRPSOOOO6CK2 PHOSPHO SITE Casein kinase / Dhosohorvlation site :142 145:SvyE337 340:SltD401 404:SqJLD481 484:PSJOOO1 7TftEATP CTQ A ATP/CTPbmainc Ma mntif A fUccc' 170 177:PS

6、CCCC9Gdr<TtG；KT413 416：rGRR蛋白质二级结构分析WjWIXS A > 'F*JIa辆 ”WWW29>dIaJUIAU 37 血LJk bwL09Ehmus sibiricus ATPase a业廣含仃比较F M的 级结初.体中较人的Q螺旋仃7个.较人B片层仃11个。Secondary structure prediction of a subunit of ATPase in Elymus sibiricus蛋白质三级结构推测及保守结构域分析3D structure prediction of ATPase a subunit in Elymu

7、s sibiricus由5个B折 叠组成的N 端区域蛋白质三级结构推测及保守结构域分析呈漏斗状的由8个平 行的B折杵和8个螺旋构成的邙桶3D structure prediction of Rubisco large subunit in Elymus sibiricus保守结构域Fig.5.9 The C-lerminal domain ofATPase alpha subunit in Elymus sibiricusFi&58 The N-terminal domain ofATPase alpha subunit in Elynius sibiricus保守结构域Fig.5.1

8、0 The central domain of ATPase alpha subunit in Elymus sibiricus核心结构域氨基酸保守性分析核心结构域中，ATP结合位点是由卜列15个飙垒酸残宰來构成的（图511护驶示 部分）：Aig172, Lys176, Thr177» Ala,7g» Tyrl96» Gin201, Asp262> Asp263, Lys266> Glu32l> Serw, Pro550, Arg*® Pro356, Arg*叭 由猱基酸序列同源性比较可以看出，这些位点在 进化中均十分保守（图515中红

9、色显示部分）<»孩心结构域中，P环是负贵与三磷酸盐结合区域，其构成通式是：（G/A）XXXXGK（T/S）,川草2廿老芒麦ATPasea亚基屮由卜列8个氨基酸残基构成（图512屮 显示区）:Gly'7°, Asp171, Arg,7 Gln,7 Thr174, Gly,7S Lys,%, Thrl77o 由氮丛酸庁列同 源性比较可以看出,这些位点在进化中均十分保守（图515中显示纟U部分）。图5.11 Elymus sibiricus ATPase a亚基ATP结合位点图5.12 Elymus sibiricus ATPase ct亚基三磷酸盐结合位点核心结构

10、域氨基酸保守性分析核心区域内，大冬氨酸盐结合位点山卜冽5个氨基酸残基构成（图5. 13斗分）:Ley258, He259, He260, Tyr261, Asp262o该区域在不同种间均保持（图515中 V 显示部分）在核心区域内，Q亚宰与B亚垒的结合区域见图（图514中 显示部分），由卜.列34个氨基酸残基构成:lie116, Asp", Pro®, Ala134, Gly136, He137, Arg140, Ser%Arg172, Glnl7 Arg?叫 Aid20*,Ser?叫 Ser205, Ala207, Gin208, Thr211, Arg?% Gin?&#

11、174;Aig279. Arg?叫 Pro281,Gly28Arg?臥 Gly289, Tyr29 Ser296, Glu®, Ser337, Asp34°,Asn551, Ala352» Arg355»Arg叭 在图5.15屮说色显示部分,在不同种间,有着极高的保守性。图5.13 Elymus sibiricus ATPase a亚基 天冬氨酸位点图5.14 Elymus sibiricus ATPasea亚基与0亚基结合位点F-JlsA-iMnmcBof 一 he conserved do=亘 n wx-h ATPascELpha subunhE&#

12、187;bi r iOMS61怖11 1 >«> 21bl醫130233 SBttl I2“ "201(i3901429G1哗111461361耳i5 915 723r«i b I r a ou«1 21書11 1 49 211 2130233 281 21 i2310 921 21r i34bO1 <4291 21干11 11 31 21(1"W "31 21E.» b i r a cu»18 1哗11 1 45 2118 1s 130733 70IB 1c 2319 Q7i a i膏13 4S

13、O1 -47Q1 D 1 i11513181 i591G723181e. a b i r icub233(I1 1 -45 2123330233 2«233耳i2319 92233哗134501429233c 11 14S13333膏1S QI S 7?3e» bi r ious293 *1 149 21293督130233 20203干123 1Q2293 i3-49Q1 429293 11 ( <40,3293S91S 723203 S3dvc * vIm v«mvIm V S O V I ot* VCW I m vc«vI IImi a

14、71;a»fvKet*v I AO IPV3EAYLGRVVMALAX ImiI AO I rVSHA V LOfV I HALvq»6B*vrI AO I rVODOY LOMV V NStnlkesnvktrck I AO IPVGRWLGRVVDAL I 11I AOIRV3DGYLGRVVNALIX Cr .r vrI AEIPVGEAYLGRVVDGL VOCSCGr bi I e<»»vk«tcHIAOVPVGK3YLGRVVNALGTPIDGKGF I I mSrSRL I E3F*AP<JI I SRfTSVY PT

15、MOTOL I A I D=M I P I GRGQRE L I I r I vaSCHRL I ESr«AF*a I I SRRSVYr 尸.QTOL I A I DSM I R I GRGORCL I I E I etKENRLI E3PAPG I i 3RR3VH9>.OTGI VA I DAM I P I GRGOREL I I DI esFTTRL I ES#>APO I vSRR3VHEP OYOI_ I XU OAM I P 0 GROORWL 0 I Q I pmlStmLI ESSAfJI i JSWtSVY tmtoTat. I A I DSM I r

16、 I artaOHtl. I I AVatKD!27«A II vAKftVY .ATQLVAVDAM I rVOKOOKCL I ID I no3ETRL I C3 I ARG I I SAKSVCFRI OTGI TA I QSM I P I GRGOREL I ITOT I LNOKe TOT I L NOK e VOTILNQKc TOT I L NQK c TDT I L NC3K c VOTI LNOK*I DTI I NOK «iRNA(C)rRNA(T)MlpA(C)atpA(T)1#jo1 I " g 1 30233283B33633633633

17、tt33A32020aNVlCVVVAIOQRAd3VAOVVTNFOEEc«m«YTIVVAEMADSR <OV IOVYVAI OORAS3VAOVVTTFHEEc wn YT I VVABAADSP HDWOVYVAI GQKA5S I AOVVNTLOERc MdYT I I VAATADSP qQV I OVYVAI CM3KA53VSO I VTTL FKRcMnvYT I I VAEMADS5 qHV I OVYVAICXXASSVAOVVNTrrRcMl »YT I VVA EA A MH 尸 HGV ICVYVAIOOKASSVAQVLNT

18、LKBael dYT I I VMAMANEP OVVCV V VA7OOK AATVAS I VTTLEB< « I dYTC I VAANADOPAT LOY LAT-Y 1GAA LA t Yf MY 穴I YDO L3KO AO A Yf«C3M L L L»<r<Tt-C»f UA Yf-QDVFATLOYLAAYTGAALAEYFMYREWHTLI I YOOLSKOAOAYROM3LLLRRP*>GREAYPGOVF AT LOY L3RYTGAA L A EYFMVTGRHT L7 I YDOLT»<

19、;OAOAYREM3LLLRRPf>WEAYP<iOVF ATLQYLAPYTGAALAEYFMYNaKHTL7l VCXLSKOAOAYRQMSLLLRRPPCREAYPODVF AT LOY LAPYTGAAUA6YFMYRKOHT LI I YtXJLSKOAOAYROMSLLLRRPPGREAYPOOVF ATLOYLAf»YTaATLAEYrMyTGRF*TLr I YDOL3KOAOAYREM3L L LRRTFKJRrAYRODVr ATLQY I AnYTQAA I A EYTMY NGOAT L7 I Yr OLSKOASAYRPMS I. L LRRn

20、nORCAmGDVFVLH3RLLERAAKLNsl I aeOSMTALPI veTOSGOV3AY I PTNV I 8 I TOGO I FLSADLFMA YLK3RLLERAAKLNS I I ««CSMTALPI VGTOSGDVSAY I PT NV I 3 I TOGO I FLSAOLF NA YLHtSMLLtffAAKLMdH I «T ALf/VI: TOEODVSAY I VT NV I S I TDOO I r LSAO IF NAYLMKLLtrCAAKLSde I coQSMT ALI V t TOAC»VSAY I KT

21、 NV 151 TtXlQVr LSAD I r NS YLHSRLLEAAKL3«Ql «»G3MTALRI VPTQAGDV3AY I PTMV I 31 TOGO IPL3ADLFNA YLMSRLLERAAKLNne I s«OSMTALPI VFTOEGOV3AY IRTNV I 3 I TOGO IFLAAGLF N3 YLHSRLLERAAKLSdH I ScOSMTALR*/IfcTOAGDVSAY IPTNV ISITDGOIFLSODLFNA2322322322322022922922922922Q220236 236 23»

22、; 23» 230230235 2GIRT A I m/Q I 5VSR VG « mI »< «m»<GIR*»A I nvGI3V5RVQ«M*<alkMBR<r/ G IRA I nvGl SVdRVOs«eaoHeM*<a/ OIRPA I nvOISV3VQsa«aik«a*<a-/ OIRRAInvGISVSRVGseeak «mK a“ aLftr-A I nva I SVSKVGBMMapK mbctz aiMVA I nv<2

23、 I SV3»«va a I k<rzCR IK 1CR «k 1ax Ik 1aK Ik 1*K Ik 11 K 1 1 1 1 |r丁el.1QMaqra«mIdR«Qr»ci 1 c c c 1 r f<1 1I datanol#" c c c 1 1 |f 1erearasd1dk a"datonal tonal tr nq1 C»« IK t 1t 1da<141414141-<141222222Fig.5.16 Expression levels of the

24、 atpA cDNA fragment in the C and T by Northern blot.1OO 1120-72 h: Treatment by chilling al 2'C; 72-112 h: Culture at 25*C after chilling-stress at 2C; C: Control; T: Treahnenl;I 13: 0, 4, & 12, 24, 36, 4& 60, 72, 80, 100,112 h; Open bar and solid bar stand for control and treatment.第二节基

25、因诱变技术诱变技术物理诱变:化学诱变:随机突变基因定向诱变:1）缺失突变2）插入突变3）点突变单点和多点突变221缺失突变1.限制酶片段缺失2.限制酶位点缺失3低聚核昔酸定向缺失先人工合成一段低聚核昔略使其中一些已如核昔酸缺失, 然后使之与相应ss-DNA理火，用DNA聚合酶合成另一条链，转 化大肠杆菌，分离缺失体2.2.2插入突变在已知的tfc虫处插入一段DNA,共右法与缺失突变体十分相似，只廷反其道行之插入突变2.2.3点突变2.寡聚核昔酸定向突变T4 DNAPol IKT转化大肠杆菌III3 重叠延伸诱变厲在一已知DNA序列中引起点突变，缺失突变和插入突变23，5Pl535'分别

26、扩增3*丫4. 改进的双引物诱变5. 简并寡聚核昔酸引物第三节蛋白质的改造2. 3. 1蛋白质的定点改造酶活性.稳定性.最适PH.特异性药品的改造：白细胞介素2的半胱胺酸变 为丝氨酸或丙氨酸，活性增强，稳定性 提高。2. 3. 2其他改造方法:性内切酶的改造第四节酶工程4. 1概念4. 2酶的生产 4. 3酶的固定化技术4. 4酶反应器 4. 5生物传感器4. 1概念4. 1.酶学基础.酶是一种生物大分子，主要是蛋 V 白质，它能催化有机体各种生物I化学反应，使新陈代谢活动得以Substrete 有序地进行酶的特性：高效性，专一性，可控性影响酶活性的因素：温度、pH.、底物与产物浓度、变构作用

27、ActivesiteSubtilraleActive SiteEnzymeRegulatory SiteProduct AProduct BAllosteric ActivatorCompetitive InhibitorProduct ASubstrateProduct BActive SiteEnzyme4. 1 2酶工程 （Enzyme Engineering）是从应用的目的出发研究酶. 应用酶的牛寺异 彳生催it功育皂，并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。酶工程主要有以下几个方面的研究 酶的分离、提纯、人批量心产及新酶和酚的应用开发； 酚和细胞的固定化及酶反应器的研究（包扌舌

28、酶传感器、 反应检测等）； 酶主产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶） 的研究； 酚的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关 系的研究 有机相中酶反应的研究； 酶的抑制剂、激活剂开发及应用研究； 抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。4. 2酶的生产 4. 2. 1酶的微生物发酵生产微生物产酶的优点：产量高，活性高； 容易培养；微生物酶类齐全，易改造。生产方法与培养基。提高酶产量的措施：添加诱导物；降低 阻遏物浓度；使用表面活性剂；添力口产 酶促进剂。 4. 2. 2酶的分离纯化步骤：细胞收集、破碎一溶剂抽扌_离心一过滤浓缩一干燥纯化精制：离心.透析.

29、过滤.层析.电泳 4. 2. 2酶的保存:目的：保持酶的稳定性和活性/溶液保存/晶体或干粉保存4. 3酶的固定化技术:定化酶,是指限制或固定于特定空间位置的酶。经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂O制备固定化卿的过程称为酶的I定化。定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有一定纯度的酶，也可以是结合在菌体（死细胞） 或细胞碎片上的酶或酶系。固定化酶优点 可以多次使用，而且在多数情况下，酚的稳定性 提高。 反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残 留酶，易于纯化，产品质量高。 反应条件易于控制，可实现转牝反应的连续化和 自动控制。 酶的利用效率高

30、，单位酶催化的底物量增加，用 酶量减少。 比水溶性酶更适合于多酶反应。固定化酶的制备技术（1）吸附法制备固定化酶技术是利用载体表而性质作用将酶吸附于其表而的固定化方法， 又分为物理吸附法和离子交换吸附法。（2）包埋法制备固定化酶技术包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化包埋法两类。凝胶包埋法 是将卿或细胞限制于高聚物网络中的技术；微囊化是将酶或细 胞定位于不同构型的膜外壳的技术。（3）交联法制备固定化酶技术交联酶法是向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶 分子内或分子间彼此连接成网络结构而形成固定化酶的技术。细胞固定化技术将细胞限制或定位于特定空间位置。 是目前研究开发的重点.其优点在于： 无需进

31、行酶的分离纯化。 细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率 高。 细胞内酶比固定化酶稳定性更高。 细胞内酶的辅因子可以自动再生。 细胞木身含多酚体系，可催化一系列反应。 抗污染能力强。固定化细胞制备技术(1) 载体结合法 是将细胞悬浮液直接与水不溶性的载 体相结合的固定化方法。(2) 包埋法将细胞定位于凝胶网络内的技术称为包埋法 ,这是固定化细胞中应用最多的方法。常用的载体有卡拉 胶、聚乙烯醇、琼脂、明胶及涨藻胶等。(3 )交联法用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法 称为交联法。(4 )无载体法靠细胞自身的絮凝作用制备I古I定化细胞的 技术称为无载体法。常用的酶和细胞的固定化载体吸附法包埋法共价结合法物理吸附离子吸附矶土DBAE-纤维素卡拉胶纤维索膨润十TE