端粒、端粒酶

1、 端粒与端粒酶端粒与端粒酶Telomere and Telomerase端端 粒粒 端粒端粒 是位于真核细胞线性染色体末端的是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构特殊结构, ,由一段重复串联的由一段重复串联的DNADNA序列与端序列与端粒结合蛋白构成；粒结合蛋白构成； 端粒端粒具有稳定染色体具有稳定染色体, ,防止末端降解和融合防止末端降解和融合的功能；的功能； 端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短年龄的增长而变短, ,端粒端粒DNADNA逐渐变短而消逐渐变短而消失失, ,可导可导 致染色体稳定性下降并导致衰老致染色体稳定性下降并导致衰老。

2、端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。 端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白复合体复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。 端粒酶是一种核酸核蛋白酶端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳以维持端粒长度的稳定性。定性。 许多研究表明许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋

3、亡、衰老。胞增殖、癌变、凋亡、衰老。 端粒的发现端粒的发现 1938 Muller X-ray Drosophila 末端极少发生缺失和倒位末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定构，使染色体趋于稳定.并定名为并定名为Telomere 1938 B.McClintock 顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。 推测染色体末端具有特殊端粒结构。推测染色体末端具有特殊端粒结构。七十年代七十年代 端粒分子组成确定端粒分子组成确定八十年代八十年代 端粒酶的发现端粒酶的发现九十年代九十年代 端粒酶与细

4、胞衰老、癌症的关系端粒酶与细胞衰老、癌症的关系二零零九年二零零九年 诺贝尔奖诺贝尔奖 伊丽莎白伊丽莎白布兰克波恩、卡罗尔布兰克波恩、卡罗尔格雷德、格雷德、 杰克杰克绍斯塔绍斯塔端粒的结构与功能端粒的结构与功能ChromosomeDNAGene 1Gene 2TelomeresTelomeresTTAGGG 1. 1.端粒的组成端粒的组成 端粒端粒DNADNA与端粒结合蛋白与端粒结合蛋白 端粒端粒DNADNA 重复重复: : 端粒端粒DNADNA由高度重复短核苷酸序列组成。由高度重复短核苷酸序列组成。 人：人：-TTAGGG-TTAGGG-重复序列重复序列 保守：保守： 为不含功能基因的简单、高

5、度重复序列为不含功能基因的简单、高度重复序列, 在生物进化过程中具有高度保守性。在生物进化过程中具有高度保守性。 不同物种的端粒不同物种的端粒DNA 序列存在差异序列存在差异。 人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5TTAGGG3的重复序列。体细胞的端粒有限长度（telomere restriction fragments TRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。 端粒端粒DNA由两条互相配对的由两条互相配对的DNA 单链组成单链组成, 其其双链部分通过与端粒结合蛋白

6、质双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和和TRF2 结合结合共同组成共同组成t环环(t loops)。这种。这种t 环特殊结构可维持染色环特殊结构可维持染色体末端的稳定体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性保持染色体及其内部基因的完整性,从从而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不能稳定存在。能稳定存在。 端粒端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶的一顶“帽子帽子”，它既可保护染色体不被降解，又，它既可保护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（避免了端粒对端融合（end-end fusion）以及染

7、色体）以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞“分裂时分裂时钟钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。 端粒端粒DNA的长度的长度： 端粒端粒DNADNA的平均长度因物种而异。的平均长度因物种而异。 端粒端粒DNADNA的长度总是波动变化，随遗传或营养状态而改变。的长度总是波动变化，随遗传或营养状态而改变。人体中，随细胞分裂，会缓慢缩短。人体中，随细胞分裂，会缓慢缩短。Telomere length端粒端粒DNA重复重复序列序列T四膜

8、虫，四膜虫，酵母，酵母，植物，植物，蚕，蚕，人人 端粒结合蛋白端粒结合蛋白 与端粒与端粒DNADNA上的特异序列相结合的蛋白上的特异序列相结合的蛋白质称为端粒结合蛋白。质称为端粒结合蛋白。 人端粒重复序列结合因子人端粒重复序列结合因子(Telomeric(Telomeric repeat factorrepeat factor，TRF)TRF)，包括，包括TRF1TRF1和和TRF2TRF2。 TRF1TRF1通过负反馈机制抑制端粒增长，通过负反馈机制抑制端粒增长，稳定端粒长度，其并不抑制端粒酶稳定端粒长度，其并不抑制端粒酶(telomerase)(telomerase)的表达而是抑制它在端粒

9、末的表达而是抑制它在端粒末端的行为端的行为 TRF1 TRF1，是一个是一个60 kD60 kD的蛋白，结合同的蛋白，结合同源二聚体双链源二聚体双链TTAGGGTTAGGG重复序列，包含重复序列，包含一个一个C C端螺旋端螺旋- -转折转折- -螺旋区和一个螺旋区和一个DNADNA结合折叠同源区，结合折叠同源区，N N端是酸性区。端是酸性区。 TRF2TRF2，与与TRF1TRF1相似，但相似，但N N端碱性强。可端碱性强。可以防止染色体末端相互融合。以防止染色体末端相互融合。 两种蛋白在体外都专一与双链两种蛋白在体外都专一与双链TTAGGGTTAGGG重复序列结合，在体内则位于端粒。重复序列

10、结合，在体内则位于端粒。 人该环人该环DNA DNA 与与TRF1TRF1、TRF2TRF2结合，结合，TRF2TRF2参与参与T T环形成。环形成。“T T环环”保护保护33端对端对抗双链破坏的核酸酶作用。）抗双链破坏的核酸酶作用。）Telomere T-loop2. 2.端粒的功能端粒的功能端粒酶的结构与功能端粒酶的结构与功能端粒酶端粒酶是一种是一种RNA-RNA-蛋白质复合物，蛋白质复合物， 在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺

11、乏这种机制，它特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危）的危险 。 因 此 在 正 常 人 体 细 胞 间 永 生 化 细 胞险 。 因 此 在 正 常 人 体 细 胞 间 永 生 化 细 胞（immortalized cells）及肿瘤细胞的转化过程中可）及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞怎样能也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被家们发现

12、端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚有末被发现的酶，该酶具有标准的有末被发现的酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不多聚酶所不具备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们具备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们兴奋的是到兴奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶端粒延长的酶端粒酶的存在。端粒酶的存在。 端粒酶的结构端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体, ,由由RNA RNA 和结合的蛋白质组成和结合的蛋白质组成,

13、,是是RNARNA依赖的依赖的DNA DNA 聚合酶。它是聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒一种特殊的能合成端粒DNADNA的酶的酶, ,通过明显的模板依赖通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。方式每次添加一个核苷酸。 端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) ) 端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（TERTTERT） 端粒酶结合蛋白端粒酶结合蛋白（TEP） 1 1、端粒酶、端粒酶RNA(hTERTRNA(hTERT) ) 哺乳动物端粒酶哺乳动物端粒酶RNAs(hTRRNAs(hTR) )在许多组织的不同发育阶段在许多组织的不同

14、发育阶段, ,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。 体内端粒酶体内端粒酶RNARNA的存在对端粒酶功能至关重要，影响到的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶端粒酶RNARNA的稳定性与突变的稳定性与突变, ,也可改变体内端粒长度，并可通也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡分裂后期细胞死亡 。端粒酶端粒酶RNARNA转录模板转录模板 远端区远端区: :参与和底物的结合。参与和底物的结合。 近端区近端区: :能添加特定的核苷酸能添加特定的核苷

15、酸, ,对底物识别并不重要。对底物识别并不重要。 模板边界区模板边界区: :与端粒酶催化亚基与端粒酶催化亚基TERTTERT结合结合, ,也与端粒酶相关也与端粒酶相关因子因子Est1pEst1p和和Ku Ku 结合。结合。Telomerase RNA The template region Main TERT-binding region Template boundary element(TBE) TRE, Template recognition element Low affinity TERT binding sites Annu.Rev.Biochem 2006, 75:493-51

16、72 2、端粒酶逆转录酶、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse (Telomerase reverse transcriptase,TERTtranscriptase,TERT) ) 几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT TERT 基因基因, , 哺乳动物哺乳动物TERT TERT 的转录由许多转录因的转录由许多转录因子、激素和细胞外信号严格控制子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因不同的转录因子调节子调节hTERThTERT在不同的细胞内含物中的表达。癌基在不同的细胞内含物中的表达。癌基因因c-mycc-myc是一个受特殊信

17、号调节的可诱导癌基因是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因, , 并可与并可与H HRasRas、N NRasRas、多瘤病毒多瘤病毒MTMT、LT LT 等癌基等癌基因协同作用因协同作用, , 促进细胞无限增殖促进细胞无限增殖, , 获得永生化并获得永生化并发生癌变。发生癌变。 人端粒酶逆转录酶人端粒酶逆转录酶 （human Telomerase Reverse Transcriptase (TERT),） TERT gene : 3396bp, protein: 1131 氨基酸残基Crystal Structure of the Essential N-terminalof the telo

18、merase reverse transcriptase (TEN) C-terminal domain of TERTNature structureal & molecular biology 2006, 13: 218-225 c-mycc-myc 与与hTERThTERT Fujimoto Fujimoto等用等用c-mycc-myc 反义寡核甘酸转染白血病反义寡核甘酸转染白血病细胞细胞后后, , 这些细胞这些细胞中中端粒酶活性均能被下调端粒酶活性均能被下调, , 而而c-c-mycmyc 正义寡核甘酸无此作用。正义寡核甘酸无此作用。 Wang Wang等研究发现等研究发现c-

19、mycc-myc在正常人乳腺上皮细胞和在正常人乳腺上皮细胞和二二倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性, , 并能延长并能延长这些这些细胞细胞的寿命。因此认为的寿命。因此认为癌基因癌基因c-mycc-myc为一重要的端粒为一重要的端粒酶激活剂酶激活剂。 存在于存在于hTERThTERT核心启动子中有两个重要的核心启动子中有两个重要的c-mycc-myc 结合位点结合位点(CACGTG,(CACGTG,亦被称为亦被称为E E 盒盒) )。c-mycc-myc 诱导的诱导的hTERThTERT 表达起始速度快表达起始速度快, ,不受细胞增殖或额外的蛋白不受细胞增殖或额外的蛋白

20、合成的影响合成的影响, ,与与c-mycc-myc 引起的直接的转录激活一致。引起的直接的转录激活一致。但癌基因但癌基因c-mycc-myc 不是唯一与不是唯一与hTERThTERT基因调节有关的转基因调节有关的转录因子。录因子。 近期研究表明近期研究表明,Sp1 ,Sp1 协同协同c-mycc-myc 激活激活hTERThTERT的转录的转录, ,可能还有其他因子可能还有其他因子, ,如如Bcl-2 Bcl-2 抗凋亡基因、抗凋亡基因、E6HPV16 E6HPV16 型型蛋白蛋白，以及经过以及经过一些一些蛋白激酶的磷酸化使蛋白激酶的磷酸化使hTERThTERT 上调。上调。但在诸多不同类型的

21、瘤细胞中但在诸多不同类型的瘤细胞中, ,致致hTERThTERT上调的基本激活上调的基本激活剂是剂是c-mycc-myc。 TERTTERT内的内的N-N-残基对多种功能是重要的残基对多种功能是重要的, , 包括与端粒包括与端粒酶酶RNARNA结合、端粒酶结合、端粒酶RNA RNA 装配和催化作用、与装配和催化作用、与p53 p53 的相的相互作用和细胞永生化。互作用和细胞永生化。 TERTTERT的的C-C-残基也在人类原始纤维母细胞的永生化、残基也在人类原始纤维母细胞的永生化、端粒组装的竞争、核仁内定位、引物结合和渐进性延长端粒组装的竞争、核仁内定位、引物结合和渐进性延长等方面起重要作用。

22、等方面起重要作用。 3、端粒酶相关蛋白、端粒酶相关蛋白(TEP) 端粒酶相关蛋白端粒酶相关蛋白-1(TEP1)-1(TEP1)是一多功能的是一多功能的RNA RNA 结合蛋白，结合蛋白，TEP1 TEP1 缺失导致缺失导致rRNArRNA 水平的显著降低以及水平的显著降低以及TEP1 TEP1 和和rRNArRNA 的丢失的丢失, ,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。 生存动力神经细胞基因生存动力神经细胞基因(SMN) (SMN) 产物产物热休克蛋白（热休克蛋白（hsphsp）90 90 、其他涉及到其他涉及到TERTTERT转录后修饰的转录后修饰的蛋白包

23、括磷酸酶蛋白包括磷酸酶-A-A、Akt Akt 、cAblcAbl 、p53 p53 和和PARPPARP。PinX1 PinX1 与人与人TERTTERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。体外共表达时抑制人端粒酶活性。 芽殖酵母蛋白芽殖酵母蛋白Est1p Est1p 和和Est3p Est3p 这两个蛋白与体内端这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关。粒酶的功能有关。Est1p Est1p 足以使端粒延长。但是足以使端粒延长。但是, ,在无在无Est1pEst1p存在的情况下存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持融合也足以维持端粒长度。端粒长度。人端粒酶人端粒酶RNA( human

24、Telomerase RNA (hTR or TERC). hTR : 451 nt, Telomerase is composed of both RNA and proteinTelomerase Telomerase is a specialized reverse transcriptase, contains both RNA and ProteinScience 1997, 276: 561-567端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) )端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（TERTTERT）端粒酶结合蛋白（端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNARNA是第一个被克隆的端粒酶是第

25、一个被克隆的端粒酶组分。组分。端粒酶端粒酶RNARNA含有与同源端粒含有与同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAGGG的互补序列的互补序列, ,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板区切割此模板区, ,能使体外消除端粒酶能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。延长端粒的功能。人类人类TERTTERT（hTERThTERT）基因为一单拷贝基因）基因为一单拷贝基因, ,定位于定位于5p15. 33 ,5p15. 33 ,具有具有7 7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T T。破坏破坏TERT TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短。将消除端粒酶

26、活性并致端粒缩短。TEP1TEP1、生存动力神经细胞基因生存动力神经细胞基因(SMN) (SMN) 产物产物、 hsp90hsp90 、 PinX1PinX1、 Est1p Est1p 和和Est3pEst3p THE END REPLICATION PROBLEM TELOMERASEIf cells dont have telomerase, what happens with telomeres after many cells divisions?端粒酶延长端粒端粒酶延长端粒DNA Inchworn modelTelomere T-loopTelomeres are packaged

27、into a unique structure - a T-loopGreen = Telomere-specific proteinsT-loop seenin the electronmicroscopeTelomeresStructural elements of a eukaryotic chromosome(5)(TxGy)n (3)(AxCy)nThe TxGy strand in telomeres folds back upon itself, forming G quadruplexes.Metal ion (K+) binding is required to form a

28、 stable structure.TelomeresStructural elements of a eukaryotic chromosome(5)(TxGy)n (3)(AxCy)nJ. Mol Biol. (2002), 320, 911-924TelomeresJ. Mol Biol. (2002), 320, 911-924 端粒酶活性的测定端粒酶活性的测定 端粒酶的特殊性使端粒酶端粒酶的特殊性使端粒酶活性的测定在研究中显得尤为重要。基本测定方法是活性的测定在研究中显得尤为重要。基本测定方法是通过测定细胞提取物将端粒重复片段加到一个合成的通过测定细胞提取物将端粒重复片段加到一个合成

29、的寡聚脱氧核苷酸引物寡聚脱氧核苷酸引物33端的能力进行的。端的能力进行的。（1 1）TRAPTRAP法法模拟端粒结构设计单链模拟端粒结构设计单链DNADNA引物引物TSTS，端粒酶催化加上，端粒酶催化加上6 6核苷酸重复序列，然后用重复序列互补引物核苷酸重复序列，然后用重复序列互补引物CXCX对合成对合成产物产物PCRPCR扩增，电泳差扩增，电泳差6ntDNA6ntDNA条带。早期方法，只能定条带。早期方法，只能定性。性。（2 2）TRAP-TRAP-同位素图谱同位素图谱 上述反应体系加入上述反应体系加入32P32P标记标记ATPATP，32P-TS32P-TS引物，引物，PCRPCR扩增后电

30、泳，放射自显影，扫描定量扩增后电泳，放射自显影，扫描定量。（3 3）TRAP-TRAP-非同位素图谱非同位素图谱组织裂解液稀释，组织裂解液稀释，TRAPTRAP法分析，溴乙锭染色根据法分析，溴乙锭染色根据6bp6bp梯形条带在梯形条带在高低浓度出现，半定量分析。高低浓度出现，半定量分析。 （4 4）PCR-ELISAPCR-ELISA法法 按按TRAPTRAP法延伸引物，法延伸引物，PCRPCR扩增，与地高辛标记重复序列探针扩增，与地高辛标记重复序列探针杂交，杂交产物通过生物素标记引物固定于抗生物素包被微孔杂交，杂交产物通过生物素标记引物固定于抗生物素包被微孔板上，过氧化酶结合地高辛抗体检测板

31、上，过氧化酶结合地高辛抗体检测PCRPCR产物。产生有色产物，产物。产生有色产物，定量。定量。（5 5）PCR-PCR-荧光法荧光法 用荧光标记引物用荧光标记引物TSTS和和CXCX，进行，进行TRAPTRAP延伸、延伸、PCRPCR、电泳。荧光、电泳。荧光分析定量。进行分析定量。进行TRAPTRAP延伸、延伸、PCRPCR，扩增产物结合能选择结合双链，扩增产物结合能选择结合双链DNADNA的超敏荧光染料，测定电泳荧光强度，分析产生的超敏荧光染料，测定电泳荧光强度，分析产生DNADNA量与端量与端粒酶活性正比。半定量。粒酶活性正比。半定量。 端粒及端粒酶端粒及端粒酶 与衰老的关系与衰老的关系

32、端粒缩短是触发衰老的分子钟。端粒缩短是触发衰老的分子钟。 大多数正大多数正常体细胞中不能检测到端粒酶的活性。端粒随常体细胞中不能检测到端粒酶的活性。端粒随细胞分裂每次丢失细胞分裂每次丢失50-20050-200个碱基。个碱基。CookeCooke等认为，等认为，正常体细胞中端粒酶未被活化，导致端粒正常体细胞中端粒酶未被活化，导致端粒DNADNA缩缩短。可能最终制约细胞增殖能力。几千个碱基短。可能最终制约细胞增殖能力。几千个碱基的端粒的端粒DNADNA丢失后，细胞就停止分裂而衰老。最丢失后，细胞就停止分裂而衰老。最有力的证据是有力的证据是BodnarBodnar等的工作。将人端粒酶基等的工作。将

33、人端粒酶基因导入正常细胞，使端粒酶异常表达。端粒序因导入正常细胞，使端粒酶异常表达。端粒序列异常延长，细胞旺盛增殖，寿命大大延长。列异常延长，细胞旺盛增殖，寿命大大延长。 Telomere Length (humans)Number of Doublings2010Cellular (replicative) SenescenceNormal Somatic Cells(Telomerase Negative)Telomere also provide a means for counting cell division: telomeres shorten with each cycleTe

34、lomeres shorten from 10-15 kb(germ line) to 3-5 kb after 50-60 doublings(average lengths of TRFs)Cellular senescence is triggered whencells acquire one or a few critically short telomeres. 端粒缩短可引发细胞老化的机制端粒缩短可引发细胞老化的机制可能有可能有3种情况种情况 端粒端粒DNA的缩短释放了端粒结合转录因子，的缩短释放了端粒结合转录因子，该因子进而激活衰老诱导基因或灭活细胞该因子进而激活衰老诱导基因或

35、灭活细胞周期进行所必需的某些基因；周期进行所必需的某些基因； 诱导诱导DNA损伤的反应，导致细胞周期受损伤的反应，导致细胞周期受阻；阻； 端粒的缩短引起免疫功能下降，端粒的缩短引起免疫功能下降，Pommier” 早在早在1997年就观察到，受年就观察到，受HIV感染的高度免疫缺陷病人外周血单核细胞感染的高度免疫缺陷病人外周血单核细胞的端粒长度急剧缩短。的端粒长度急剧缩短。 大量的实验数据证明，端粒、端粒酶与衰老之间存大量的实验数据证明，端粒、端粒酶与衰老之间存在相关性。在相关性。在多数体细胞中，老年个体的端粒长度较年轻个体在多数体细胞中，老年个体的端粒长度较年轻个体短的多，某些细胞如短的多，某

36、些细胞如T、B淋巴细胞中的端粒酶活性淋巴细胞中的端粒酶活性随年龄的增加而下降随年龄的增加而下降 。年轻个体细胞中端粒酶活性随年龄的增长而下降年轻个体细胞中端粒酶活性随年龄的增长而下降 。 需要无限分裂能力的谱系细胞、干细胞的端粒长度需要无限分裂能力的谱系细胞、干细胞的端粒长度较长，且具有较高的端粒酶活性；而大多数具有有较长，且具有较高的端粒酶活性；而大多数具有有限增生能力的体细胞的端粒较短，不表达活性仅低限增生能力的体细胞的端粒较短，不表达活性仅低度表达端粒酶活性度表达端粒酶活性 。增生能力强的细胞及永生细胞表达端粒酶活性，即增生能力强的细胞及永生细胞表达端粒酶活性，即使同一组织的不同部分，其

37、分裂能力也与端粒酶的使同一组织的不同部分，其分裂能力也与端粒酶的活性呈正比。活性呈正比。 端粒酶阴性的细胞在引入端粒酶后，可维持端粒的端粒酶阴性的细胞在引入端粒酶后，可维持端粒的长度，细胞增生能力加强，甚至细胞永生化长度，细胞增生能力加强，甚至细胞永生化 Telomere Length Declines035651,5003,0008,000Age (years)Telomere length in base pairs(human white blood cells)Telomerase activity is repressed in somatic cells of Telomerase

38、 activity is repressed in somatic cells of multicelluarmulticelluar organisms resulting in a gradual organisms resulting in a gradual shortening of the chromosome with each cell shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reaches informational generation. As this short

39、ening reaches informational DNA, the cells senesce and die. DNA, the cells senesce and die. 细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值 长 短细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值端粒长短端粒长短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重复片段为探针检测端粒的重复片段为探针检测 胎儿细胞株胎儿细胞株婴儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株青年细胞株老年细胞株老年细胞株年龄年龄小 大端粒长度端粒长度早老性侏儒症的端粒明显较正常人短早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多

40、莉多莉”的衰老的衰老研究端粒（记时器）丢失的速率研究端粒（记时器）丢失的速率/ 年，预测人类的寿命年，预测人类的寿命 XX XY why?XX XY why?PCDPCD机制、癌细胞的无限繁殖机制、癌细胞的无限繁殖In most somatic tissues, telomerase is expressed at verylow levels or not at all - as cells divide, telomeres shortenTelomerase and SenescenceShort telomeres may be a signal for cells to senesc

41、e (stop dividing) 在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命延长延长这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系这正是人们研究的端粒酶与抗

42、衰老关系的新热点。的新热点。 端粒酶延长端粒长度以减慢细胞衰老最早的证据端粒酶延长端粒长度以减慢细胞衰老最早的证据来自来自BodnarBodnar等的研究，等的研究，19981998年其在年其在ScienceScience上刊文报道：上刊文报道：将人的端粒酶基因导入端粒酶阴性的正常人体细胞中将人的端粒酶基因导入端粒酶阴性的正常人体细胞中激活其表达并培养细胞，然后与未导入该基因的细胞激活其表达并培养细胞，然后与未导入该基因的细胞比较，发现前者端粒明显增长，细胞分裂旺盛，细胞比较，发现前者端粒明显增长，细胞分裂旺盛，细胞寿命比后者大大延长，更令人关注的是细胞并无肿瘤寿命比后者大大延长，更令人关注的

43、是细胞并无肿瘤样改变。样改变。KudoKudo等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为伴等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为伴有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志。 MattsonMattson等亦认为在研究神经细胞分化和存活中等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活端粒酶与激活端粒酶与TERTTERT功能，能较好地避免神经细胞死功能，能较好地避免神经细胞死亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变条件下的恢复。条件下的恢复。 阿尔茨海默病（阿尔茨海默病（Alzheimers diseaseAlzheimers dis

44、ease，ADAD）是）是一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者的脑血管壁中可分离出致的脑血管壁中可分离出致ADAD神经元退行性病变的神经元退行性病变的-淀粉样蛋白。淀粉样蛋白。 ZhuZhu等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中马区神经细胞中TERTTERT的功能抑制，发现显著增加了的功能抑制，发现显著增加了由由-淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡；淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡； 嗜铬细胞瘤细胞中嗜铬细胞瘤细胞中TERTTERT的过量表达会降低此种的过量表达会降低此种细胞凋亡。细胞凋亡。 其原因是其原

45、因是TERTTERT功能降低的神经细胞在暴露于功能降低的神经细胞在暴露于-淀淀粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障碍，因而引起细胞凋亡。碍，因而引起细胞凋亡。TERTTERT在神经退行性病变在神经退行性病变实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰老相关的神经退行性病变，如老相关的神经退行性病变，如ADAD和脑老化的发生和脑老化的发生等。等。 端粒缩短加快可在许多病变中观察到端粒缩短加快可在许多病变中观察到: :如如Dow

46、n Down 综合征、综合征、Werner Werner 综合征、毛细管扩张失调综合征、毛细管扩张失调症症 、先天性角化不良等、先天性角化不良等, ,虽然有些遗传异常和端虽然有些遗传异常和端粒缺陷的关系还不清楚粒缺陷的关系还不清楚, ,但可能的原因有但可能的原因有: : 端粒核酸外切酶活性和端粒核酸外切酶活性和( (或或) )有效利用的增加。有效利用的增加。端粒过度丢失。端粒过度丢失。在发育或出生后端粒补偿机制的不足在发育或出生后端粒补偿机制的不足( (端粒酶端粒酶或正性或正性ALTALT样功能样功能) )。 端粒缩短加速可由于环境的应急介导的端粒缩短加速可由于环境的应急介导的DNA DNA

47、损损害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因, ,端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征, ,但但也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆过分生长。过分生长。 细胞的死亡过程分为两个阶段细胞的死亡过程分为两个阶段, , 当端粒缩短至一关键性当端粒缩短至一关键性长度长度2-4kb2-4kb时时, ,染色体的稳定性就会遭到破坏染色体的稳定性就会遭到破坏, ,细胞开始衰老细胞开始衰老进入进入M M1期（期（mortality stage1 M M1）。在）。在M1期细胞对生长

48、因子等期细胞对生长因子等失去反应，产生失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（cell cycle checkpoints）发送周期停止信号，）发送周期停止信号，DNA合成停止，合成停止，DNA DNA 断裂断裂, ,活化活化p53 p53 依赖或非依赖或非p53 p53 依赖的依赖的DNA DNA 损伤途径。并损伤途径。并诱导诱导CDKCDK抑制物如抑制物如p21 ,p27p21 ,p27产生产生, ,导致细胞导致细胞G1G1期生长停滞期生长停滞, ,最最终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因SV40T抗原、抗原

49、、PRB ,PRB ,或或p53 ,p16 p53 ,p16 等抑癌基因失活等抑癌基因失活, ,丧失正常功能丧失正常功能, , 均能使均能使M1期的期的机制被抑制使细胞逃逸机制被抑制使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖能力，期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，次分裂后，最终到达最终到达M2期。细胞由于端粒过短期。细胞由于端粒过短, ,基因不稳定基因不稳定, ,绝大多数细绝大多数细胞死亡胞死亡, ,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活, ,端粒的功能

50、得到恢复端粒的功能得到恢复, ,基因重获稳定基因重获稳定, ,使细胞超越使细胞超越M M2期期, ,成为成为永生化细胞。永生化细胞。 端粒酶被抑制端粒酶被抑制 正常人体细胞正常人体细胞 端粒丢失端粒丢失 M1期阻滞期阻滞 SV40T抗原抗原 细胞分裂停止细胞分裂停止 Rb、P53与病毒蛋白结合、突变与病毒蛋白结合、突变 M1M2期间隔期间隔 永生化永生化 双着丝粒形成双着丝粒形成 M2期退化期退化 染色体失稳染色体失稳 端粒酶被激活端粒酶被激活 细胞凋亡细胞凋亡 端粒酶在人体细胞永生性转化中端粒酶在人体细胞永生性转化中端粒、端粒酶与肿瘤 端粒酶活化是肿瘤的显著特征端粒酶活化是肿瘤的显著特征 尽

51、管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematirealtematire Lengthening of telomere ALTLengthening of telomere ALT）机制，但其存在）机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自从从19941994年年KimKim等创立等创立TRAPTRAP法检测端粒酶活性以来，法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数

52、人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国学者在学者在400多例来源于多例来源于12 种不同组织的原发肿瘤病种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8，而肿，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4。 附表附表 人体组织中端粒酶活性人体组织中端粒酶活性 肿瘤部位/类型 与肿瘤邻近正常组织/良性病变 肿瘤组织（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%

53、）结肠0/45（0）22/23（95.6%）肝1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）肾0/55（0）40/55（72.7%）神经母细胞瘤 0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%）脑6/8（75%）其它（头顶部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合计 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8) ShayShay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果，总结了正常组织（检测结果，总结了正常组织（196196例），原位癌（例），原位癌（410410

54、例），恶性肿瘤（例），恶性肿瘤（20312031例）和癌旁组织（例）和癌旁组织（690690例）的例）的端粒酶的阳性率，它们分别是端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%0.5%、30%30%、85%85%和和11%11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为的阳性率为85.0%85.0%95.0%95.0%，而对应的癌旁或良性病变，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。SumidaSumida等的研究结果表明等的研究结果表明, ,端粒酶在各种肿瘤中的阳端粒酶在各种肿

55、瘤中的阳性率分别为性率分别为: :口腔鳞状细胞癌口腔鳞状细胞癌80 %80 %90%,90%,食道癌食道癌87%,87%,胃癌胃癌85%,85%,肺癌肺癌80.1%,80.1%,肝癌肝癌85%,85%,乳腺癌乳腺癌85%,85%,肾癌肾癌71%,71%,胰胰腺癌腺癌95%,95%,端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性。相关性。 Orlando 等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的流行病学调查流行病学调查,结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率为为69%(345/497),正常肾组织为正常肾组织为2%

56、(7/344);膀胱癌组膀胱癌组织中端粒酶阳性率为织中端粒酶阳性率为90%(342/381),正常组织为正常组织为27% (36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为65%(436/675) ,膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为72 %(131/182) ,而正常人为而正常人为9%(47/ 486);前列腺癌组织前列腺癌组织中端粒酶阳性率为中端粒酶阳性率为80%(266/332),邻近组织为邻近组织为38%(32/83) ,前列腺上皮瘤为前列腺上皮瘤为16%(4/25) ,良性前列良性前列腺肥大为腺肥大为8%(11/129) 。 85%90%

57、的人肿瘤细胞中可以检测到端粒的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。粒维持机制改变的结果。 一般认为一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持短而得以维持,避免了细胞正常的复制避免了细胞正常的复制-衰亡机制衰亡机制的制约而获得永生性的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的生这是恶性肿瘤细

58、胞显著的生物学特征之一物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环节是癌变机制中一个十分重要的环节。 对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒长度的维持是发生端粒长度的维持,甚至在离开常规的激活时甚至在离开常规的激活时端粒长度维持机制端粒长度维持机制(TMM)的延长的延长,使初期细胞突破使初期细胞突破衰老屏障后癌变。发生的原因衰老屏障后癌变。发生的原因,最可能为过度的端最可能为过度的端粒酶激活在细胞癌变中端粒长度的保留或增加粒酶激活在细胞癌变中端粒长度的保留或增加,允允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。 一些端粒

59、酶阴性的癌症通过一种或几种一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种ALT途途经维持端粒的长度。端粒酶或经维持端粒的长度。端粒酶或ALT机制存在于绝大机制存在于绝大多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端粒的长度。粒的长度。 在一些肿瘤中也观察到一些端粒缩短的现象，在一些肿瘤中也观察到一些端粒缩短的现象，可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短，导致可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短，导致异常修复事件使染色体发生端端融合。端端融合的异常修复事件使染色体发生端端融合。端端融合的后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色体断裂后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色

60、体断裂, ,进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性。进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性。 以端粒酶为靶标的抗癌药物研究以端粒酶为靶标的抗癌药物研究 在在85%85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。(1)(1)使用端粒酶抑制剂后使用端粒酶抑制剂后, ,肿瘤细胞端粒缩短直至足肿瘤细胞端粒缩短直至足以对增殖产生负面效应以对增殖产生负面效应, ,这种时间上的滞后与起始端这种时间上的滞后与起始端粒的长度有关；粒的长度有关；(2)(2)至少在理论上肿瘤细胞存在抗端粒酶抑制剂或不至少在理论上肿瘤细胞存在抗