诃子多酚的提取分离_结构鉴定及抗氧化活性的研究

1、62009年11月第30卷第11期食品研究与开发科学研究诃子多酚的提取分离、结构鉴定及抗氧化活性的研究贝玉祥1,2，郭英3，何超2，范逸平2，高云涛2,*（1. 昆明贵金属研究所昆明贵研药业有限公司，云南昆明650221; 2. 云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆）明650031；3. 郧阳师范高等专科学校化学系, 湖北丹江口442700摘要：介绍萃取-沉淀法提取分离诃子多酚及利用红外光谱法对诃子多酚进行结构鉴定和利用Fenton 反应产生羟自由基·OH ，光照核黄素产生超氧阴离子自由基O 2-·，分光光度法研究诃子体外清除活性氧自由基的作用。用硫代巴比妥酸（TBA ）

2、分光光度法研究诃子对·OH 诱发卵磷脂脂质过氧化损伤的抑制作用。试验结果表明诃子能有效清除活性氧自由基，对卵磷脂脂质过氧损伤有显著抑制作用关键词：诃子；多酚；分离；纯化；抗氧化ISOLATION, PURIFICATION, STRUCTURE IDENTIFICATION AND ANTIOXIDANT ABILITY OF TERMINALIAPOLYPHENOLS*BEI Yu-xiang 1,2，GUO Ying 3，HE Chao 2，Fan Yi-ping 2，GAO Yun-tao 2，（1. Kunming Guiyan Pharmaceutical Co Ltd ,

3、 Kunming Institute of Precious Metals , Kunming 650221，Yunnan, China; 2. School of Chemistry and Bio-Science , Yunnan Nationalities University, Kunming 650031, Yunnan, China; 3.Departmentof Chemistry, YunYang Teachers College, Danjiangkou 442700，Hubei, China ）Abstract :Extraction -precipitation meth

4、ods used in separation of terminalia -polyphenols and structures of·OH and O 2-terminalia-polyphenols by IR spectra. Scavenging effects of terminalia on active oxygen species ·generated by Fenton reaction and riboflavine photosensitization in vitro were investigated by the means of spectro

5、photometry. The inhibition effects of terminalia on the lecithin lipid peroxidation and oxidation damage of DNA chain induced by hydroxyl radical were observed by thiobarbit uric acid spectrophotometry. The results showed that terminalia could scavenge active oxygen efficiently. It could also signif

6、icantly inhibitlipid peroxidation and oxidation damage of DNA by hydroxyl radical.Key words :terminalia ; polyphenols; isolation; purification; antioxidant ability诃子（Terminalia chebula Rotz. ）又名诃黎、诃黎勒、随风子、为使君子科植物的果实1。诃子作为中药在中医临床上广泛使用, 用于油脂抗氧化方面的研究在国内已见有专门报道2。诃子果实中含丰富的蹂质和多基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目（2007B148

7、M ）作者简介：贝玉祥（1981），男（汉），研究生，主要从事天然药物活性成分的分离分析及铂类抗癌药物合成的研究。*通讯作者：高云涛，男，教授，硕士生导师。12荣建华，李小定, 谢笔钧. 大豆肽的理化性质及其脂肪氧合酶活性的影晌J.研究与探讨, 2002, 23（8）:19-2113履新. 大麦麸皮多酚类提取物抗氧化活性和抗突变性J.粮食与鞣质和多元元酚类，约为30%40%3已有文献报道，酚类具有较好的抗氧化性4。正常人体内, 自由基与抗氧化物质处于平衡状态。一旦后者减少, 人体器官和组织的细胞膜便可能遭受自由基的进攻, 发生脂质过氧化作用, 在释放新自由基的同时, 生成低分子降解产物, 最终

8、导致细胞膜的破损、衰老和死亡5。一些天然植物的多酚类成分可形成氢自由基, 淬灭体内产生的自由基, 从而保护组织免受氧油脂,2004,6:9-12收稿日期：2008-02-24,科学研究食品研究与开发1.2.32009年11月第30卷第11期7化作用的损害, 在药理作用上表现为延缓衰老、抗突变、抗癌、杀菌消炎, 防治心血管疾病和动脉粥样硬化等功能6。抗氧化物质的缺失, 可以从外源如经常用作天然抗氧化剂的植物提取物补充, 由于它们一般无毒副作用近年来在食品和医药领域受到人们广泛关注。研究发现诃子的醇提取物有较强的清除活性氧的作用7-8和抑制体内脂质过氧化反应而导致的肝损伤作用9。诃子醇提物主要含多

9、酚类物质，由于含有酚羟基，在细胞膜发生脂质过氧化反应时，本身可脱H 氧化，提供电子给自由基，从而有效地终止自由基的连锁反应。本文主要以普洱茶醇提物为对照，研究诃子醇提物对活性氧自由基的清除作用及对卵磷脂体外脂质过氧化抑制作用，为诃子的综合利用提供一些材料。11.1试验部分材料与仪器诃子：购自云南临仓，粉质；茶多酚：四川碧馥生物科技有限公司；核黄素（V B 2）、氯化硝基四氮唑兰）：购自ChemBase 公司；番红花红（Safranine T ）；（NBT蛋氨酸；2-硫代巴比妥酸（TBA ）；三氯乙酸（TCA ）。所用试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。7200型紫外可见分光光度计：北京瑞利分

10、析仪器）；超声波清洗器；80-2公司；数显恒温水浴锅（S3120A 离心沉淀机机：上海手术器械厂；光照箱（自制，35cm ×30cm ×25cm ，光源为纯稀土节能灯，灯功率45W ）；转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。1.2方法1.2.1超声波法从诃子中提取有效成分准确称取柯子粉末5.00g 于250mL 具塞锥形瓶中。加入一定量的石油醚超声波提取30min ，抽滤，滤渣挥发干燥除去残余的石油醚，加入60%的乙醇溶液200mL 超声提取60min 、抽滤，合并滤液即得含多酚的浸提液，浸提液加入沉淀剂，并同时在不断搅拌下加入5%Na 2CO 3水溶液调节溶液的pH 值在6左右。

11、溶滤渣用蒸馏水洗液静置30min 待沉淀析出进行抽滤，涤3次后，分出滤饼。1.2.2转溶和乙酸乙酯萃取将滤饼移至烧杯中加入1mol/L的盐酸，不断搅拌使沉淀溶解，调节溶液的pH 值在4左右。将溶液移入分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，55旋转蒸发，然后将浓缩液移至烧杯中，放在真空干燥器中抽真空常温真空干燥7d ，即得干燥的诃子多酚。柯子总多酚的测定诃子多酚产品的初步分析对提取得到的产品进结果行WGH-30/6型双光束红外分光光度计的扫描，如图1。图1诃子多酚产品的红外光谱图Fig.1Infrared determination of the content of terminali

12、apolyphenol由1图可知，36003300附近有强宽的吸收峰，17001450的吸收峰为芳环上的为O-H 伸缩振动；900650有多个吸收峰，说明苯环上有多个骨架振动；取代结构；13001000附近有C-O 伸缩振动峰，由IR 谱可初步确认化学组成为多酚类物。1.2.4多酚含量的测定取1.2.2中的干燥的诃子多酚0.2g 配制2mg/mL的待测液。以酒石酸亚铁比色法10测定总多酚的含量。本文以100mg/L没食子酸为标准，测定波长540nm ，A=0.0184c-0.0101（r=0.999），以（1）式计算回归方程：85.38%柯子总多酚的含量为：诃子多酚=c V/0.2×

13、100%=85.38%1.2.51.2.5.1诃子多酚的抗氧化活性的测定超氧阴离子自由基的产生及清除活性测定采用光照核黄素11的方法用0.05mol/LpH =7.4的PBS 缓冲液为溶剂，配制1.67×10-5mol/L核黄素，0.01mol/L蛋氨酸，9.2×10-5mol/L氯化硝基四氮唑兰（NBT ）。分别分别加入稀释好的不同浓度取上述3种溶液各2.0mL ，的诃子提取液（样品）和普洱茶提取液（对照）1.0mL ，空白管以1.0mL 缓冲液代替样品溶液。置于光照箱中光照30min ，取出后以缓冲溶液为参比于560nm 处测定（2）式计算。溶液的吸光度。清除率按清除率

14、=A 0-A ×100%1.2.5.2（2）（1）A 0为空白管的吸光度；A 样为样品管的吸光度。式中：羟自由基的产生及清除活性测定12采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基（Fenton 反应），该反应产生的羟自由基可使番红花红褪色。针对这一特点来研究诃子中多酚对羟自由基的清除能力。82009年11月第30卷第11期食品研究与开发2.2对Fenton 反应产生·OH 的清除作用科学研究取0.15mol/LpH 7.4的磷酸缓冲溶液1.0mL ，40mg/L番红花红1.0mL ，0.945mmol/LEDTA-Fe （）（新鲜配1.0mL ，不同浓度的样品溶液0.5mL 、3

15、%H2O 21.0mL 置）（新鲜配置），混合后在37水浴中反应30min 后在520nm 处测定吸光度As 。空白组以0.5mL 蒸馏水代替样品测定吸光度A 0，对照组以1.5mL 蒸馏水代替H 2O 2和样品测定吸光度A ，用3.5mL 蒸馏水代替番红花红、EDTA-Fe( 、H 2O 2、样品，1.0mL 磷酸盐缓冲溶液，调零，并按（3）式计算清除率。清除率=A S -A 0×100%1.2.5.3（3）对Fenton 反应产生·OH 的清除作用见图3。Fig.313图3诃子与茶多酚对·OH 的清除作用Scavenging effect of termina

16、lia and tea on ·OH对脂质过氧化抑制活性的测定取0.5mL 卵磷脂溶液（用200mg 卵磷脂溶解于30mL 10mmol/LpH 7.4PBS ，冰浴振荡），加入pH 7.4PBS 缓冲液1.0mL ，不同浓度的样品溶液1mL ，2.5mmol/L混匀后于37水浴中反应EDTA-Fe( 1.0mL ，45min ，再加入28（g/L）的TCA2.0mL ，1（g/L）的TBA 1.0mL ，混匀后置于100沸水浴中加热10min ，冷却后在532nm 处测定吸光度A 样，用PBS 缓冲液调零，空白管用PBS 缓冲液代替样品测吸光度A 0。并按（4）式计算抑制率。抑制率

17、=A -A ×100%22.1结果与讨论对超氧阴离子自由基的清除作用诃子多酚对超氧阴离子的清除作用见图2。（4）当诃子中多酚的当量浓度40mg/L时，清除率达最大，最大清除率为96.25%。而茶多酚的当清除率达最大，最大清除率为量浓度40mg/L时，67.10%。这说明诃子多酚对·OH 的清除作用强于茶多酚。2.3对脂质过氧化的抑制作用在532nm 下测定诃子多酚对卵磷脂脂质过氧化的抑制作用，结果见图4。Fig. 4图4诃子与茶多酚对脂质过氧化的抑制作用Inhibitions of lipid peroxidation by terminalia and puer-tea当

18、抑制率达到50%时，诃子中多酚的当量浓度为:IC50=0.16g/L，当诃子中多酚的当量浓度0.24g/L时，抑制率达最大，其抑制率高达57.22%，而茶多酚的当量浓度为:IC50=0.07mg/mL，当茶多酚的当量浓度0.24g/L抑制率为64.90%。这说明诃子多酚与茶多酚对卵磷脂脂质过氧化的抑制作用相近。图2诃子与茶多酚对光照核黄素产生超氧阴离子自由基的清除作用Fig.2Scavenging effect of terminalia and tea on O 2-·generatedby riboflavine photosensitization3讨论1）用光照核黄素的方法产

19、生O 2-·，可使氯化硝基四氮唑兰产生蓝色物质，该物质在560nm 处有最大吸当清除率达到50%时诃子中多酚的当量浓度为:IC 50=0.16g/L，诃子中多酚的当量浓度0.26g/L时，清除率达最大，最大清除率为73.57%。而茶多酚的当量浓度为IC 50=0.10g/L，当茶多酚的当量浓度0.26g/L时，最大清除率为79.53%，这说明诃子多酚与茶多酚对O 2-·的清除作用相近。收峰。随着反应的进行，蓝色物质的生成就越多，加入诃子多酚可使O 2-·的产生受到抑制，进而蓝色物质的生成也受到抑制，因此，测定该波长下的吸光度值的变·的清除能力。化，可反映

20、诃子多酚和茶多酚对O 2-2）根据Fenton 反应的原理，H 2O 2在Fe 2+存在的条件下可生成·OH ，·OH 可使番红花红褪色，番红花红在科学研究食品研究与开发2009年11月第30卷第11期9番茄红素提取工艺参数的研究侍朋宝1，陈海菊2，柴菊华1，刘福1（1. 河北科技师范学院食品工程系，河北昌黎066600；2. 河北科技师范学院园艺园林系，河北昌黎066600）摘要：对影响番茄红素提取的各因素，如浸提溶剂、料液比、提取温度、浸提时间、pH 值等进行研究，结果表明：在番茄糊中添加丙酮：乙醚21（体积比）的混合溶液，料液比为13（g/mL），在30，pH 6的环

21、境下浸提4h 可取得最佳提取效果。关键词：番茄红素；提取；影响因素STUDY ON TECHNOLOGICAL PARAMETER OF LYCOPENE EXTRACTIONSHI Peng-bao 1, CHEN Hai-ju 2, CHAI Ju-hua 1, LIU Fu 1（1. Food Engineering Department, Hebei Normal University of Science &Technology ，Changli 066600, Hebei, China; 2. Department of Horticulture and Landscape

22、, Hebei Normal University of Science and Technology, Changli 066600，Hebei ，China ）Abstract :Several technological parameters of lycopene extraction such as different leaching liquor, the ratio of tomato and liquor, the temperature, the extraction time, the pH were studied. The experiment results sho

23、wed that the optimum process was add the mixture of acetone:aether =21（v/v）into tomato mash, the ratio of tomato mash and leaching liquor was 13（g/mL）, leaching 4h under the condition of 30and pH=6.Key words :lycopene ；extraction ；influencing factor作者简介：侍朋宝（1979），男（汉），讲师，硕士，从事食品科学专业研究。!4张杰. 鞣质的药理作用（）抗氧化, 降脂, 降压等多种作用J.520nm 处有最大光吸收，加入诃子多酚后，可有效阻·OH 止番红花红褪色，进而反映诃子多酚和茶多酚对的清除能力。3）卵磷脂可被·OH 氧化损伤产生丙二醛（MDA ）类似物，硫代巴比妥酸（TBA ）可与MDA 类似物反应生成粉红色物质，该物质在532nm 处有最大光吸收，加入诃子多酚后，可有效抑制MDA 的生成，进而反映诃子多酚和茶多酚的抗脂质过氧化作用。综上所述，与公认的天然抗氧化剂茶多酚相比，诃-子多酚能够有效地清除O 2&