预处置对急性缺血再灌注肝脏保护机制的初步探讨

1、    预处置对急性缺血再灌注肝脏保护机制的初步探讨            关键词：肝；再灌注损伤；一氧化氮；氧；自由基    中国病理生理杂志000304    摘 要 目的：探讨预处置对缺血再灌注损伤肝脏的防护及其机制。方法：随机将家兔分为对照组、缺血再灌注组和预处置组，复制肝缺血再灌注损伤(HIRI)模型，观察反复3次缺血5 min再灌注5 min(预

2、处置)后再缺血45 min再灌注45 min，对血浆、肝组织一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)水平、谷丙转氨酶(ALT)值及肝细胞形态学改变的影响。结果：肝缺血再灌注期间，预处置组血浆及肝组织NO水平明显高于缺血再灌注组(P<0.05)；而MDA水平和血浆ALT均显著低于缺血再灌注组(P<0.05和P<0.01)；且与仅行游离、不阻断肝血流的对照组比较均无明显差异；肝细胞形态学异常改变也明显减轻。结论：预处置可通过提高体内NO水平及降低体内氧自由基水平而减轻HIRI。    中分类号 R 575.5 文献标识码 A  

3、;  文章编号 1000-4718(2000)03-0203-04    The protective effect of preconditioning on rabbit liver during ischemia and reperfusion and its potential mechanism    WANG Wan-tie, LIN Li-na, XU Zheng-jie, LI Dong, FAN Zhou-xi, WANG Zhong-min   

4、 (Department of Pathophysiology, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325003, China)    Abstract AIM：To investigate the protective effect of preconditioning on rabbit liver during total ischemia and reperfusion and its mechanism. METHODS: Using hepatic ischemia and reperfusion i

5、njury (HIRI) model in rabbits, animals were randomly divided into three groups: control group (A), non-preconditioning group(B) and preconditioning group(C), different effects of preconditioning on several parameters including alanine aminotransferase (ALT) activity and levels of nitric oxide (NO) a

6、nd malondialdehyde (MDA) in plasma or liver tissue as well as hepatocellular morphological changes were measured and observed during HIRI. RESULTS:In C group NO levels of plasma and liver tissue were higher than those in B group (P<0.05);While MDA levels and ALT value in plasma were lower than th

7、ose in B group (P<0.05 and P<0.01); and there were not significant differences between C and A group (P>0.05); abnormal morphological chages of liver cells in A group were ameliorated remarkably too during HIRI. CONCLUSION:Preconditioning can attenuate HIRI by improving NO level and reducin

8、g oxygen free radicals level.    MeSH Liver; Reperfusion injury; Nitric oxide; Oxygen; Free radicals    预处置(preconditioning)即反复短期缺血再灌注，基本不引起肝脏损伤，但对其后的长时间缺血、再灌注却增强了耐受性1，其机制尚不清楚，尤其与一氧化氮(nitric oxide, NO)及氧自由基(oxygen free radicals, OFR)水平的关系少有报道。本研究观察预处置对家兔肝缺血再灌注

9、过程中生化、组织方面的影响变化，初步探讨了预处置对较长时间肝缺血再灌注所致肝损伤(hepatic ischemia and reperfusion injury, HIRI)的作用机制，为临床保护肝脏提供理论基础和实验依据。    材 料 和 方 法    一、模型复制    健康日本大耳白兔(家兔)30只，雌雄兼有，体重1.62.8 kg，氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg iv)麻醉，分离一侧颈外静脉以备采血。消毒开腹，暴露肝门，于尾状叶上方游离肝左叶、中叶、右中叶及方形叶的

10、血管、胆管，用无损伤钳夹闭血管，造成该4叶完全性缺血，45 min后松夹重新灌注45 min形成HIRI2。    二、动物分组    随机将家兔分为3组：对照组(A组)，10只，仅行游离肝脏但不阻断其血流；缺血再灌注组(B组)，10只，缺血45 min后再灌注45 min；预处置组(C组)，10只，反复3次缺血5 min再灌注5 min后再缺血45 min再灌注45 min。    三、标品采集    3组分别在肝缺血前、缺血45 m

11、in、再灌注45 min自颈外静脉取血以测定血浆一氧化氮代谢产物(NO-2/NO-3，NOx)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)值，并在实验毕立即处死动物，取左中叶肝组织制成10%匀浆，以测定NOx及MDA水平。同时取少许左中叶肝组织以备光镜、电镜观察。    四、检测方法    硝酸还原酶法测定NO-2/NO-3含量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，赖氏法检测ALT值，前2种试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。HE染色光镜

12、观察，LKB-V型超薄切片机切片，H-500型透射电镜观察。    五、统计分析    所有数据均以±s表示，采用组间、组内t检验判断均数差异显著性。    结 果    一、3组动物HIRI时血浆NOx、MDA含量及ALT值的变化，见表1。    二、3组动物HIRI时肝组织NOx及MDA含量的测定值，见表2。    表1 3组动物HIRI时血浆

13、NOx、MDA含量及ALT值的变化及比较    Tab 1 The change and comparison of NOx，MDA contents and ALT value in plasma during HIRI among three groups (±s,n=10) Group    NO-2/NO-3(mol/L)    MDA(mol/L)    ALT(U)    A

14、    Pre-Is    30.35±8.27    5.60±0.21    38.90±5.00    Is45min    30.30±8.80    5.70±0.74    39.50±5.04 &

15、#160;  Rp45min    29.88±8.61    5.57±0.71    38.30±4.28    B    Pre-Is    29.16±12.88    5.70±0.50    38.

16、10±2.85    Is45min    26.09±9.32    5.98±0.55    47.30±4.63    Rp45min    19.66±9.24    7.70±0.66    61.70

17、7;8.28    C    Pre-Is    29.84±8.94    5.63±0.75    39.00±6.58    Is45min    28.17±8.53    5.78±0.75  

18、60; 41.20±5.74    Rp45min    27.94±7.80    6.81±0.75    46.90±7.54    P<0.05，P<0.01，vs Pre-Is; P<0.05, P<0.01,vs Is 45 min; P<0.05，P<0.01，vs A group; &#

19、160;  P<0.05, P<0.01, vs B group; IS=ischemia; RP=reperfusin表2 3组动物HIRI时肝组织NOx、MDA含量的变化及比较    Tab 2 The change and comparison of NOx, MDA contents in    hepatic tissue during HIRI among three groups (±s，n=10) Group    N

20、O-2/NO-3    (mol/)    MDA    (mol/)    A    23.56±5.04    1.21±0.16    B    14.74±5.09    1.9

21、2±0.25    C    19.80±4.36    1.51±0.32    P<0.05，P<0.01，vs A group; P<0.05，P<0.01，vs B group    三、肝细胞形态学改变    光镜下，A组肝细胞形态基本正常；B组肝细胞肿胀、空泡变性及点状坏死；C组则表现为散在肝

22、细胞肿胀、变性，其程度、范围均明显轻于B组。电镜下，A组肝细胞形态正常，细胞连接完好，线粒体、粗面内质网及毛细胆管未见扩张(1)。B组肝细胞明显肿胀，其表面微绒毛减少，狄氏间隙明显扩大，细胞连接疏松，肝细胞内可见大量粗面内质网扩张，线粒体显著肿胀甚至空泡化，毛细胆管明显扩张，腔内微绒毛稀少，个别见胆汁淤积现象(2)。C组局部肝细胞肿胀，其表面微绒毛较多，狄氏间隙轻度扩大，粗面内质网略扩张，线粒体轻度肿胀，个别呈空泡化，毛细胆管稍扩张，腔内微绒毛未见显著减少(3)。    Fig 1 Group A, TEM×15 000  

23、  Mitochondria, endoplasmic reticulum and bile capillaries were normal    1 对照组肝细胞线粒体、内质网及毛细胆管    讨 论    近年研究发现，NO水平下降和OFR水平升高及其引发的脂质过氧化反应是HIRI的主要发生机制35。Stuehr等证实，NOx为指示NO水平的较好指标。而测定脂质过氧化反应的代谢产物MDA含量，可间接反映OFR的生成及其所致组织细胞损伤的程度。本研究发现

24、，肝缺血、再灌注时，血浆NOx含量显著降低，MDA含量及反映肝细胞功能损伤程度的敏感指标-ALT值明显升高，尤以再灌注后为著，而且NOx、MDA与ALT分别呈显著的正相关关系(r=0.376, P<0.05; r=0.730, P<0.01)；肝组织NOx明显低于对照组，MDA显著高于对照组；肝细胞形态学改变显著异常。可见，NO减少和OFR过多及其引发的脂质过氧化反应是HIRI的主要因素之一。另外，血浆NOx与MDA水平的相反变化又呈高度相关关系(r=0.572, P<0.01)，说明机体NO水平下降和OFR水平升高可能互为因果，共同促使HIRI的发生发展。 

25、60;  Fig 2 Group B, TEM×15 000    Mitochondria was swelling significantly, endoplasmic reticulum and bile capillaries became dilating remarkably    2 缺血再灌注组肝细胞线粒体、内质网和毛细胆管的变化    Fig 3 Group C, TEM×10 000   

26、; Mitochondria became swelling lightly, endoplasmic reticulum and bile capillaries became dilating lightly    3 预处置组肝细胞线粒体、内质网和毛细胆管的变化    本实验结果亦显示，C组动物缺血45 min、再灌注45 min时，ALT值明显低于B组(P<0.05和P<0.01)，肝细胞形态学异常变化明显减轻。表明预处置对缺血再灌注肝脏有明显的保护作用。  

27、60; 从表可知，C组动物血、肝NOx均明显高于B组，MDA则显著低于B组，且两者与A组亦无明显差异。揭示预处置一方面能提高体内NO水平而抑制内皮素合成6及调节局部灌流，抑制低血流量下的血小板聚集，并与超氧化物结合形成无毒代谢产物NO-3，从而使肝细胞避免反应性氧中间物所致损害7；另一方面可降低体内OFR水平，减轻组织脂质过氧化反应程度8，从而有效地保护急性缺血再灌注肝脏。孙经建等9亦证实，预处置可明显减轻线粒体电子传递链活性的损害，增加肝细胞内ATP的产生，延缓ATP的衰竭，有效地保护线粒体的功能，进而减轻HIRI。当然，预处置亦能防止膜通透性的增强，减轻线粒体及细胞的肿胀，从而抑

28、制不可逆损伤的发生10；也可以诱导细胞内蛋白激酶C激活，进而引起底物蛋白磷酸化而实现肝细胞的保护作用1；而且亦可能通过对枯否细胞代谢和功能的调节而减轻HIRI，这仍有待进一步研究。另外，预处置由于反复血流再灌注(3次)，肝组织的糖原及腺苷酸类分解产物如乳酸、氢离子、非离子型氨、无机磷酸盐等被冲走，从而减轻了肝细胞的酸化程度及水肿，一定程度上达到了防治HIRI的目的。    基金项目 浙江省卫生厅科研基金资助(No.98A087)    参 考 文 献    1 刘秀华. 预处

29、理保护作用的普遍性及其机理探讨J. 生理科学进展，1998，29(1)：3941.    2 Hasselgren PO, Bilber B, Fornander J. Improved blood flow and protein synthesis in the postischemic liver following infusion of dopamineJ. J Surg Res, 1983, 34(1):4452.    3 Kirschemer RE. Role of iron and oxygen-

30、derived free radicals in ischemic-reperfusion injury J. J Am Coll Surg, 1994, 179:103117.    4 Saito A, Matsuno N, Kozaki K, et al. Change in plasma nitrite nitrate level after orthotopic liver transplantation on pigs J. Transplant Proc, 1996, 28(3):17611762.    5 王万铁，徐正，林丽娜，等. 脂质过氧化反应在家兔肝缺血再灌注损伤中的作用J. 中国应用生理学杂志，1998，14(3)：2