重组人生长激素基因的转染和基因表达产物的定量分析

1、    重组人生长激素基因的转染和基因 表达产物的定量分析        摘要目的：定量分析基因表达产物人生长激素(hGH)，并确定基因表达期限。方法：我们利用磷酸钙介导的方法将重组hGH基因导入培养的人胚皮肤成纤维细胞内，之后用Northern杂交证实转染细胞能够表达hGH基因。在此基础上又采用放免法对hGH进行了定量测定。结果：从细胞转染的第12天算起，hGH水平逐渐提高，到23天进入一稳定表达阶段，到90天仍在进行稳定表达。此时每毫升培养液中的细胞数为1.3&

2、#215;106个，hGH含量为79.32±3.2663ng。结论：转染细胞至少能持续表达hGH 90天。关键词重组人生长激素基因基因转染基因表达基因治疗 Transplantation of the transfected cells with recombinant hGH gene VI:gene transfection and quantitative analysis of gene expression productHu Zhiqiang, Dai Qinshun, Yu Kangzhen, et al. Department of Neurosurgery, Fir

3、st Clinical College, Harbin Medical University, 150001AbstractObjective: To quantitative analyze the gene expression product-hGH, and determine expression time limit. Methods: we use Northern blotting to prove the human fetal skin fibroblasts (hSF), which were transfected with recombinant hGH gene b

4、y calcium phosphate transfection system, could express the foreign hGH gene. On the basis of above researches, we adopted radioimmunoassay (RIA) for quantitative analyze of hGH. Results: hGH content gradually increased on the 12th day after transfection. The gene expression began to enter the steady

5、 expression stage on the 23rd day, and still expressed sustainedly hGH on the 90th day. During the stage, there were 1.3×106 hSF in a milliliter medium, hGH content was 79.32±3.2663ng/ml. Conclusions: The transfected hSF can express hGH sustaintedly for at least 90 days.Key wordsRecombinan

6、t hGH geneGene transfectionGene expressionGene therapy目前，体细胞基因治疗面临三个主要问题，(1)有效的基因转染，(2)持续稳定的基因表达，(3)细胞移植后的免疫排斥。本研究在对人胚皮肤成纤维细胞进行成功转染的基础上，利用放免法和Northern杂交对hGH基因的表达进行定性定量分析，以便从中了解基因表达情况，为实现自体移植治疗垂体性侏儒症的理想目标奠定实验基础。材料与方法1.pNMG3质粒构建：质粒pNMG3(加拿大Drchang提供)含有鼠金属硫蛋白启动子(mMT-I)驱动的hGH基因及猴病毒40早期启动子(SV40)控制的选择性标记基

7、因新霉素磷酸转移酶(neo)基因。它是通过连接pxGH5的3.9Kb，EcoRI片段，即完整的mMT-I/hGH融合基因片段到质粒pSV2 neo的EcoRI位点上构成的，见1。1质粒pNMG32.磷酸钙介导的基因转染：在无菌条件下，从一自然流产的死胎上取约3厘米2的皮片，剪碎，进行消化培养(2)。当培养的人胚皮肤成纤维细胞进入对数增殖阶段时将细胞按15传代。将传代的细胞于转染前重新培养24小时，此时每毫升培养液中含4.5×105个细胞。转染前3小时更换一次培养液。之后制备1.5ml磷酸钙(GIBCO)-DNA复合物，其中pNMG3质粒为7l，相当于31.5g。3ml培养瓶中复合物加

8、入量见附表。转染后的细胞用G418进行筛选，每毫升培养液中G418的有效剂量是400g。然后对筛选后的细胞进行克隆化。当细胞增殖至107108时进行RNA和蛋白质分析。附表培养瓶中磷酸钙-DNA复合物的含量培养瓶编号磷酸钙-DNA复合物含量(l)注1100215032004250530063507-G418对照8-空白对照注：G418对照：为加G418进行筛选的细胞空白对照：为正常培养的成纤维细胞3.Northern杂交：采用J.Sambrok分子克隆上标准技术分析转染细胞和未转染细胞总RNA，探针为3.9Kb EcoRI片段，并利用地高辛标记和检测试剂盒(GIBCO)进行分析。4.用放免法动

9、态监测基因表达产物：当培养瓶中细胞形成单层时，每毫升培养液中含有1.3×106个细胞，换下的培养液-20保存，待测hGH，人血清生长激素放免试剂盒购于天津医学生物工程有限公司。结果1.基因转染：转染后第一天，成纤维细胞表面有许多颗粒沉着，细胞在形态上仍保持梭形，但细胞明显“消瘦”。转染后7天，2号瓶中开始有极少量细胞恢复了成纤维细胞原有的形态特点，二天后细胞克隆扩大，细胞数量增多，对细胞进行克隆化。另外，除2号瓶内细胞转染获成功外，其它均未成功。表明在每毫升培养液中加150l磷酸钙DNA复合物转染人胚皮肤成纤维细胞是最佳剂量，此时每毫升培养液中含转染细胞4.2×105个。同

10、时，G418对照组细胞经G418一周的筛选细胞逐渐退化，表面有许多颗粒沉着，最终死亡，脱落，由单层形成拉网。此时，正常对照细胞量呈过度生长。2.Northern杂交结果：生理状态下，人皮肤成纤维细胞不能表达hGH基因，而本研究通过Northern杂交证实转染后的成纤维细胞能够表达外源性hGH基因，所获杂交带包含大约900个核苷酸，其中转录mMT-I顺序的核苷酸为64个，hGH顺序为817个，另外，还包括修饰片段。3.放免测定结果：从细胞转染后的第12天算起，培养液中hGH含量逐渐增加，到23天进入一稳定表达阶段，此时每毫升培养液中含有1.3×106个细胞，hGH含量为79.32

11、77;3.2663ng。到本实验结束时，即细胞转染后第90天，基因表达仍在稳定进行，见2。讨论目前，用于重组蛋白传递系统的细胞有成纤维细胞(1)，肝细胞（2），成肌细胞（3，4），上皮细胞（1），其中以成纤维细胞应用比较广泛，而且2用RIA检测培养液中hGH含量具有明显优势：(1)便于取材，(2)体外易成活，并增殖传代，(3)易于基因转染，(4)易于皮下注射移植，(5)易于与注射部位皮下组织整合，(6)能有效传递重组蛋白质进入循环系统，参与机体代谢。当我们对培养的成纤维细胞进行基因转染时，外源性目的基因可能不与宿主细胞基因组整合，形成瞬时转染和表达(5)；也可能与宿主细胞基组整合(3，4，随机

12、插入宿主细胞基因组中的任意位置，形成稳定转染和表达。这样外源性DNA的随机插入，可能导致宿主细胞内源性有利基因结构的破坏和失活，或激活有害基因(如癌基因)。另外，导入人体细胞内的外源性目的基因，其表达水平也难以预测，所以，如何提高基因正常转化效率，实现目的基因的定位整合一直是人们追求的目标。80年代初发展起来的基因定位整合技术或基因打靶，就是利用DNA体内同源重组的原理，将外源基因稳定地插入特定的位点，再经适当筛选，从而得到即定的转化细胞。对于稳定转染细胞，一方面可通过自体移植跨越组织相容性障碍，使其伴随宿主终生；另一方面可通过其对外源性基因的稳定表达，实现基因治疗的最终目标。而对瞬时转染和表

13、达的细胞，可应用低温保存技术，将细胞加以保存，以便不断提供移植物来源，使基因治疗得以延续。Seldon等人的研究指出，hGH基因在转染细胞内进行瞬时表达时，基因表达产物可以在转染24小时后的细胞培养液中测得，3天后快速增加，第二周时相对稳定，从第11天起，合成和分泌量逐渐减少，第三周hGH基因表达停止，偶尔表达时间超过6周。而我们的实验结果表明，从细胞转染的第12天算起，hGH量逐渐增加，到23天时进入一个稳定表达阶段，持续到本实验结束，即转染后第90天仍在进行稳定表达，说明我们转染并克隆后的细胞很可能在进行持续稳定的基因表达。当然，在将重组人生长激素基因应用于治疗垂体性侏儒症以前还有大量的工

14、作有待开展，包括如何提高基因的稳定转染率，并向定位整合技术方向发展。选择一种更加理想的重组蛋白细胞传递系统。通过大量动物实验，证实基因治疗的安全性，可靠性和可行性。采用基因枪或注射法将裸DNA直接导入宿主细胞内，将为人类采用“基因药物”预防和治疗疾病开辟更加广阔的前景。参 考 文 献1Tai IT, Sun AM. Microencapsulation of recombinant cells a new Delivery system for gene therapy. J FASEB, 1993，7:1061-1069.2胡志强，杨富明，刘恩重，等.腺垂体同种异体移植实验研究 :新生大鼠腺

15、垂体细胞培养.功能性及立体定向神经外科杂志，1993，6(4):3-5.3Barr E, Leiden JM. Systemic delivery of recombinant protein by genetically modified myoblasts. Science,1991,254:1507-1509.4Dhawan J, Lydia CP, Grace KP,et al.Systemic delivery of hman growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts. Science,1991,254:1509-1512.5Selden RF, Howte KB, Rowe ME,