迭香酸对D半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究

1、迭香酸对D半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究【摘要】目的 观察迷迭香酸对D半乳糖诱导的衰老小鼠的抗氧化作用。方法 昆明小鼠连续6 w颈背部皮下注射D半乳糖1 mgg-1d-1复制亚急性衰老小鼠模型。造模的过程中，3个给药组(低、中、高剂量) 分别以100、200和400 mgkg-1d-1的迷迭香酸分析纯灌胃；同时设立3个含有等效剂量迷迭香酸的迷迭香提取物给药组（1 000、2 000和4 000 mgkg-1d-1)对比灌胃。实验6 w后处死动物,测定血清和脑中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性、甘油三酯（TG）水平；以及进行耐缺氧实验。

2、结果 高剂量的迷迭香酸能明显提高衰老小鼠血清和脑中的SOD活力(P0.01)、GSHPx活性(P0.05)，降低MDA含量(P0.05)和TG水平(P0.05)，且能明显延长小鼠常压耐缺氧时间(P0.05)。结论 迷迭香酸通过提高抗氧化酶活性，清除自由基，减少过氧化脂质生成而抗衰老。 【关键词】 迷迭香酸；D半乳糖；衰老小鼠；抗氧化迷迭香酸具有多种生物活性，Chen等1报道具有较强的抗氧化活性,其作用强于咖啡酸,绿原酸,叶酸等。目前,对迷迭香酸的研究主要集中在抗炎2、抗病毒3、抑制肿瘤4以及在食品工业中的抗氧化活性等方面,而对其耐缺氧作用、抗衰老作用的研究却相对较少。本实验拟观察对比迷迭香提取

3、物以及迷迭香酸对衰老小鼠血清和脑中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性、甘油三酯(TG)水平以及常压耐缺氧时间的影响，对迷迭香酸的抗衰老作用及其机制进行初步探讨。1 材料与方法1.1 动物 中澳合资米歇尔生物制品有限公司动物中心提供的健康昆明种小鼠，体重(202)g，雄性，生产许可证：SCXK（鲁）20030011。在温度为(222) 、湿度40%60%、12 光照交替的环境中饲养。自由进食标准饲料、摄水。小鼠适应性喂养1后随机分为8组：空白对照组、衰老模型对照组、迷迭香酸低、中、高剂量）组和迷迭香提取物低、中、高剂量组。1.2 实验药品与试

4、剂 迷迭香酸南京青泽医药科技开发有限公司产品。迷迭香提取物粉剂，黄色粉末(迷迭香酸：10.6%)：上海康九化工有限公司生产，批号：SP0607031。D半乳糖：上海试剂二厂产品，批号为F20050422。盐酸普萘洛尔片：江苏常州第四制药厂生产，批号：050726。MDA、SOD、GSHPx检测试剂盒、蛋白质定量试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。TG试剂盒为中生北控生物科技股份有限公司产品。1.3 造模与给药 参照文献5方法制备亚急性衰老小鼠模型。除空白对照组外，其余各组小鼠每日颈背部皮下注射10%的D半乳糖生理盐水溶液，注射容量为0.1 ml/10 g体重，1次/d，连续6 w。空白对照组

5、颈背部皮下注射同等容量的生理盐水。造模的同时，迷迭香酸低、中、高剂量组分别以每日100，200和400 mg/kg的迷迭香酸灌胃，迷迭香提取物低、中、高剂量组分别以每日1 000，2 000和4 000 mg/kg的迷迭香提取物灌胃，空白对照组与衰老模型对照组以同等容量蒸馏水灌胃。连续给药42 d。每7 d称体重1次，根据体重调整用药量。1.4 常压耐缺氧实验 亚急性衰老小鼠模型造模成功后，分别从空白对照组，迷迭香酸以及迷迭香提取物各剂量组中随机选取10只小鼠。从衰老模型对照组中随机选取20只小鼠，其中10只设为盐酸普萘洛尔阳性对照组。盐酸普萘洛尔阳性对照组腹腔注射盐酸普萘洛尔0.2 mg/1

6、0 g体重，给药1次。给药15 min后，将各组小鼠逐只放入装有20 g钠石灰的250 ml密闭的广口瓶内，每瓶1只，加盖以凡士林密封瓶口，观察并记录每只小鼠呼吸停止作为缺氧死亡时间。1.5 检测指标 末次给药后24 h，将小鼠摘除眼球取血，常规分离血清。将小鼠断颈处死，于无菌条件下迅速取出脑组织，制备成10%的脑组织匀浆，离心后取上清液备用，采用考马斯亮蓝染色法定量脑匀浆蛋白。严格按照试剂盒方法测定血清和脑中的SOD、MDA、GSHPx、TG值。1.6 统计学方法 数据以xs表示，采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和两组间比较Dunnet t检验。2 结果2.1 体征状况 与空白

7、对照组相比，衰老模型组小鼠皮下连续注射D半乳糖4 w后逐渐出现毛色暗淡，松散无光泽，形体瘦弱，行动缓慢，自发性活动减少，精神萎靡不振，反应不灵敏等衰老征象，且随给药时间延长，表现愈加明显。迷迭香酸各剂量组小鼠体征状况介于模型组和空白对照组之间，但随着剂量增高，小鼠毛色、光泽、反应灵敏度等情况逐渐得以改善。与迷迭香酸各剂量组相比，含有等效剂量迷迭香酸的迷迭香提取物各组小鼠的体征状况较好。2.2 体重变化 体重的改变是研究衰老变化的重要生理指标之一，过早的出现变化可说明衰老的程度。从图可以看出，给药2 w后，小鼠体重增加量普遍下降。原因可能在于：灌胃操作对食道黏膜有一定刺激，影响动物食欲，引起体重

8、下降。但经过一定的适应期，小鼠体重又有所回升。衰老模型对照组的体重增加量显著小于空白对照组(P0.01)；迷迭香酸、迷迭香提取物各剂量组对衰老小鼠的体重均无影响(P0.05)。2.3 迷迭香酸对衰老小鼠血清和脑SOD、MDA、GSHPx的影响 由表1可见，衰老模型组与空白对照组相比，其血清和脑SOD活性、GSHPx活性显著降低(均P0.01)，而MDA含量显著升高(均P0.01)，显示出机体抗氧化能力下降，而脂质过氧化产物增多。与衰老模型组相比，迷迭香酸组都能不同程度地提高衰老小鼠血清和脑SOD活性、GSHPx活性，同时降低MDA含量 (P0.05，P0.01)，尤以中、高剂量效果最为明显，呈

9、现量效关系。与迷迭香酸各剂量组相比，含有等效剂量迷迭香酸的迷迭香提取物各组对于小鼠血清和脑SOD、GSHPx的升高以及MDA的降低程度都大于相应的迷迭香酸组。表1 迷迭香酸对衰老小鼠血清和脑SOD、MDA、GSHPx的影响（略）与空白对照组比较：1)P0.01；与衰老模型组比较：2)P0.05，3)P0.01图1 迷迭香酸对衰老小鼠体重的影响（略）2.4 迷迭香酸对衰老小鼠血清TG的影响 衰老模型组血清TG（1.181.04）mmol/L较空白对照组（0.490.12）mmol/L显著升高(P0.01)；与衰老模型组相比，迷迭香酸低剂量组（1.050.78）mmol/L无显著差异(P0.05)

10、，而中（0.890.22）mmol/L、高剂量组（0.800.34）mmol/L都能明显降低衰老小鼠血清中的TG(均P0.05 )；迷迭香提取物各剂量组也能降低小鼠血清中的TG，但低剂量组（0.920.43）mmol/L无显著差异(P0.05)，中（0.770.24）mmol/L、高剂量组（0.680.17）mmol/L效果最为明显(P0.05，P0.01)。2.5 迷迭香酸对衰老小鼠常压耐缺氧时间的影响 与空白对照组(20.252.45)min相比：衰老模型组耐缺氧时间(16.422.16)min显著下降(P0.01)；盐酸普萘洛尔阳性对照组小鼠耐缺氧时间(23.363.77)min显著延长

11、(P0.01)，因为盐酸普萘洛尔能阻断心肌的受体，产生负性肌力作用，使物质代谢减慢，降低心肌耗氧量，提高心肌耐缺氧能力。与衰老模型组相比，迷迭香酸中(17.343.04)min、高剂量(18.462.53)min能明显提高衰老小鼠耐缺氧时间(P0.05)，低剂量(16.552.31)min虽能提高小鼠耐缺氧时间，但无显著差异(P0.05)。迷迭香提取物中(19.232.79)min、高剂量(20.112.37)min也能明显提高小鼠耐缺氧时间(P0.05，P0.01)，低剂量组(17.873.08)min则与衰老模型组无显著差异(P0.05)。3 讨论 本实验中衰老模型组在连续注射D半乳糖6

12、w后，小鼠血清和脑SOD活性、GSHPx活性显著下降，MDA含量、TG水平显著升高，耐缺氧时间和体重明显下降，同时还出现了一系列的衰老体征，说明本实验中衰老模型的建立是成功的。 根据自由基学说理论，机体衰老时,抗氧化系统抗氧化能力下降,自由基代谢产物增加,进而加速机体衰老。因而提高抗氧化酶的活性,降低自由基代谢产物的生成，是延缓衰老的重要途径6。本实验结果显示：给予中、高剂量的迷迭香酸可显著提高机体抗氧化酶活性，降低MDA含量和血清TG水平，且随着迷迭香酸剂量的升高呈现量效关系。提示迷迭香酸可显著降低机体的氧化负荷，抑制脂质过氧化产物MDA的产生，减轻由于脂质过氧化反应而导致脂肪蓄积引起的TG

13、升高。缺氧是临床上常见的病理过程，机体对缺氧的耐受性取决于机体的代谢耗氧率和代偿能力。在低氧环境下,机体内发生一系列氧自由基代谢改变,表现为抗氧化能力下降和脂质过氧化反应增强。本实验结果显示：中、高剂量的迷迭香酸能提高衰老小鼠的常压耐缺氧时间。其作用机制可能是迷迭香酸能使机体耗氧量减少，氧自由基的生成随之减少。而氧自由基的生成量越少，机体的抗氧化能力就越强，寿命就越长7。 鼠尾草酸、迷迭香酸和迷迭香酚是迷迭香提取物中的三种最有效的抗氧化组分，它们的抗氧化活性依次递减8。本试验结果显示：含有等效剂量迷迭香酸的迷迭香提取物对衰老小鼠机体氧化抗氧化系统及耐缺氧能力的作用比单纯使用迷迭香酸的作用效果好

14、，由此推测：迷迭香提取物对D半乳糖诱导的衰老小鼠抗衰老的作用正是迷迭香酸和其他有效成分协同作用的结果。迷迭香酸作为迷迭香提取物抗衰老的主要有效成分之一，其机制可能是由于迷迭香酸能够作为断链型自由基终止剂9，捕获过氧自由基，抑制过氧化氢以及脂质过氧化产物的产生，由于生成的酚氧自由基相对稳定，从而阻断了自由基链的传递和增长,进而抑制了氧化反应。由此可见，迷迭香酸可以有效减少机体内的氧化性损伤，改善机体的抗氧化能力，其抗衰老作用是多方面的，可以将其作为一种抗衰老药物加以开发和应用。【参考文献】 1 Chen JH，Ho CT.Antioxidant activities of caffeic aci

15、d and its related hydroxycinnamic acid compoundsJ.J Agric Food Chem,1997；45(7):23748.2 Takano H，Osakabe N，Sanbongi C,et al.Extract of Perilla frutescens enriched for rosmarinic acid，a polyphenolic phytochemical，inhibits seasonal allergic rhino conjunctivities in humansJ.Exp Biol Med，2004；229（3）:2475

16、4.3 Kim HK，Lee HK，Shin CG,et al.HIV integrase inhibitory activity of agastache rugosaJ.Arch Pharm Res，1999；22(5):5203.4 Hooker CW，Lott WB,Harrich D.Inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcriptionJ.J Virology，2001；75（7）:3095104.5 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学M.第5版.北京：人民卫生出版社，2001：14657.6 牛嗣云，庞晓静,陈 龙，等.松花粉对亚急性衰老模型大鼠抗衰老作