重复水高压注射介导hHGF 表达载体在小鼠体内的持续高效表达

1、重复水高压注射介导hHGF 表达载体在小鼠体内的持续高效表达重复水高压注射介导hHGF 表达载体在小鼠体内的持续高效表达朱传龙,李毓雯,高人焘,李宜,聂青和 作者单位：230001 合肥市安徽医科大学附属安徽省立医院感染病科（朱传龙，高人焘，李宜）；儿科（李毓雯）；西安市第四军医大学唐都医院传染病科、全军感染病诊疗中心（聂青和）【摘要】目的构建hHGF 表达载体并通过水高压注射法研究hHGF 在小鼠体内的持续表达。方法从慢性乙型肝炎患者肝组织提取总RNA，RT-PCR 扩增出hHGF 基因的cDNA 片段，将目的片断克隆至pMD18-T 载体，酶切和测序鉴定，然后将目的片断酶切回收后插入pcD

2、NA3.1 质粒，构建真核表达载体pcDNA-hHGF，通过重复水高压注射法将pcDNAhHGF 导入小鼠肝脏，并在首次水高压注射后第0、3、6、9、12、15、18 和21 天分别收集小鼠血清和肝组织，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测hHGF 在小鼠体内的表达情况。结果扩增出了长约2187bp 的基因片段，并将其克隆至pMD18-T 载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-hHGF 中hHGF 基因亚克隆至pcDNA3.0 载体，酶切鉴定无误；首次水高压注射后不同时间检测外周血和肝脏均有hHGF 的高水平表达。结论成功构建了hHGF 真核表达载体pCMV-hHGF，重复水高压注射法可将该基因导入

3、小鼠肝脏并获得持续高效的表达。【关键词】促肝细胞生长因子；肝脏；水高压注射；基因表达；小鼠Sustained and high expression of human hepatocyte growth factor in mice following repeated hydrodynamicinjections of nakedplasmid ZHU Chuanlong，LI Yuwen，Gao Rentao，et al. Department of Infectious Disease，AffiliatedProvincial Hospital，Anhui MedicalUniversi

4、ty，Hefei 230001，China【Abstract 】Objective To construct human hepatocyte growth factor expression vector （pCMV-hHGF） and charac terize the expression of pMD-hHGF in vivo by repeated hydrodynamic injections in mice. Methods Total RNA was ex tracted from liver tissue of a patient with chronic hepaitisB

5、，cDNA was obtained by reverse transcription，hHGF cDNAwas amplified and cloned into pMD18-T vector and the sequences were identified by retriction endonucleases and sequencing assay. hHGF gene was dissected from pMD-hHGF and recloned into pcDNA3.0. pCMV-hHGF was analyzed by restriction endonucleases

6、to ensure the orientation. After the plasmid was transfected into mouse livers by repeated hydro dynamic injections，we collected plasma and livers of mouse at day0，3，6，9，12，15，18 and 21 after the first hydrodynam ic injection，and then detected the expression of hHGF by ELISA. Rusults A 2187bp gene f

7、ragment was obtained andcoloned into pMD18-T vector，and the sequence was correct. hHGF gene was subcloned into pcDNA3.0 vector，and thenrestriction endonucleases assays showed the correct orientation. The level of hHGF expression could be detected by enzyme linked immunosorbent assay after the first

8、hydrodynamic injection. Conclusion hHGF expression vector （pCMVhHGF）has been successfully constructed and repeated hydrodynamic injections can promote sustained and high expressionof hHGF in mice.【Key words 】Hepatocyte growth factor；Hydrodynamic injections；Gene expression；Mice肝细胞生长因子（hepatocyte grow

9、th factor，HGF）又种多功能生长因子。HGF 具有很强的促血管内皮细胞增称扩散因子（scatter factor，SF），是由间质细胞产生的一殖和促血管生成作用，同时还能抑制细胞凋亡和减轻组织纤维化，已经在治疗肝纤维化及肝衰竭等疾病中展现出良好的应用前景1耀3。本研究构建了人hHGF 真核表达载体pCMV-hHGF，并通过重复水高压注射法将该质粒导入正常小鼠肝脏，获得hHGF 在小鼠体内的持续高效表达，为进一步开展针对肝脏疾病的基因治疗研究奠定了实验基础。材料与方法一、实验动物SPF 级Balbc/J 小鼠80 只，雌雄各半，6耀8 周龄，体质量18耀20g，购自安徽省实验动物研究中

10、心。随机分为实验组和对照组，每组40 只。二、主要仪器与试剂美国Beckman-Coulter 公司Allegra21R 低温离心机，上海安章TGL-16G 台式普通离心机，上海精宏实验设备有限公司DK-8D 型电热恒温水槽，德国Biometra 公司T3 Thermocycler PCR 仪。pcD 原NA3.0 购自Invitrogen 公司，pMD18T 载体购自大连宝生物公司。PCR 扩增所用引物由上海英骏生物技术有限公司合成。TaqDNA 聚合酶购自MBI Fermentas 公司，DNAMarker DL2000 购自大连宝生物公司，DNA 凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omi

11、ga 公司，限制性内切酶BamH 玉和Xba玉购自大连宝生物公司，T4 DNA 连接酶购自Promega 公司，感受态JM109 大肠杆菌购自大连宝生物公司，hHGF ELISA 试剂盒购自美国ADL 公司。三、水高压注射（hydrodynamic injection） 按小鼠体质量的10%计算质粒注射溶液的体积，20g 的小鼠注射液为2 mL，将100滋g 的pCMV-hHGF 或pcDNA3.0 对照质粒溶入2 mL 复方NaCl 溶液中，并于5耀7 秒内将此溶液经小鼠尾静脉快速推入体内。在首次注射后，每3 天用同样的方法重复注射一次，总共注射7 次；对照组用pcDNA3.0 空载体注射。

12、四、hHGF 的表达分别于首次水高压注射后第0、3、6、9、12、15、18 和21 天处死实验组与对照组小鼠5 只，并取外周血与肝组织置-80 益保存。血清经分离后按试剂盒说明书操作步骤采用ELISA 法检测hHGF 水平； 肝组织经匀浆后，加细胞裂解液，离心后取上清，通过考马斯亮兰行总蛋白定量，并检测hHGF 水平，计算每mg肝组织总蛋白中hHGF 的含量（ng）。五、重组质粒的构建、克隆及鉴定取慢性乙型肝炎患者肝组织10 mg，按Trizol 试剂说明书操作提取组织总RNA，以总RNA为模板进行逆转录，得到肝组织细胞的总cDNA 。以肝组织细胞cDNA 为模板，用hHGF 引物（上游引物

13、为5-ATTGGATCCATGGCGCCCTTTGCATCTCTG-3引入BamH 玉酶切位点，下游引物为5-CGCGTCTAGAC ，TATGACTGTGGTACCTTAT-3，引入Xba玉酶切位点）扩增hHGF 的全长cDNA，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，连接于pMD18T 载体，将重组体转化感受态JM109 大肠杆菌，筛选出阳性克隆。用限制性内切酶图谱分析和DNA 测序（Invitrogen 公司）对重组体进行鉴定。序列无误后，对重组体pMD-hHGF 进行BamH 玉和Xba 玉双酶切，分离并纯化小片段hHGF，连接于同样经过BamH 玉和Xba玉双酶切并纯化的大片段pcD

14、NA3.0，将重组体转化至感受态JM109 大肠杆菌内，筛选出阳性克隆。用限制性内切酶图谱分析pCMV-hHGF 。六、统计学分析测定结果以均数依标准差（x依s）表示，采用SPSS13.0 软件包进行t 检验，P约0.05 为有显著性差异。结果一、重组质粒pCMV-hHGF 的构建用经典分子克隆方法，首先设计合成引物，以慢性乙型肝炎患者肝组织总cDNA 为模板经PCR 扩增HGF，然后通过T-A 连接插入到T 载体中，酶切鉴定正确后，进一步测序证实与Genebank 中公布的大鼠HGF CDS 序列完全相符，最后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1，酶切鉴定正确（图1、2）。1：DNA 分子量

15、标准；2：pCMV-hHGF 的双酶切（Xba 玉和BamH 玉）产物；3：pMD-hHGF 的双酶切（Xba 玉和BamH 玉）产物；4：hHGF的PCR 产物（2187bp） 二、小鼠外周血hHGF 表达水平取实验组与对照实用肝脏病杂志圆园园9 年4 组动物外周血后分离血清，经ELISA 法检测hHGF 含量， 结果显示血清hHGF 水平逐步上升，并于首次水高压注射后第12 天血清hHGF 达到最高水平（13.32 依1.08 ng/ ml）第15、18 和21 天血清hHGF 水平略有下降，但仍能维持在，较高水平，而对照组血清hHGF 水平基本为0 ng/ mg（图3）。三、小鼠肝组织h

16、HGF 表达水平的变化实验组与对照组动物肝组织匀浆，经ELISA 法检测hHGF 含量，结果显示实验组肝组织hHGF 表达水平逐步上升，并于首次高压注射后第21 天肝组织hHGF 达到最高水平（134依12.58 ng/mg），而对照组肝组织hHGF 水平基本为0 ng/ mg（图4）。讨论HGF 在1980 年代被发现，因它对肝细胞具有强的丝裂原作用而被命名为肝细胞生长因子4。Stoker 等发现成纤维细胞分泌一种能促进上皮细胞集落扩散的细胞因子，称为离散因子5。通过对这两种细胞因子的结构和功能的研究，发现HGF 和SF 为同一物质6。人的HGF 基因定位于第7 号染色体长臂（7q2111）

17、，DNA 长度约为70 kb，包含18 个外显子和17 个内含子。1989 年Nakamura 等4成功克隆了人的全长HGFcDNA 。HGF 基因编码含有728 个氨基酸的蛋白质。成熟HGF 的相对分子量在非还原状态下为90kD，由60kD 的琢链和30kD 的茁链经二硫键连接而成的异二聚体，经前体蛋白分解断裂产生。HGF 具有潜在的肝脏营养功能，如增加肝细胞再生和抑制肝细胞凋亡。此外，它对肾脏和肺同样具有“营养”功能。因此，HGF 作为一种抗凋亡和细胞保护的药物可作用于各种组织，阻止多器官功能衰竭的发生，是目前重型肝炎临床治疗的常规药物。然而矛盾的是重型肝炎/肝衰竭患者体内虽然HGF 的水

18、平很高，但缺乏肝细胞再生的证据。鉴于重型肝炎患者肝脏炎症水肿及纤维化明显，肝窦及狄氏腔胶原化显著，肝窦内皮细胞基底膜形成，肝窦及肝内小血管阻塞。当较大血管阻塞时，引起肝梗塞，肝血流量和血容量明显减少，肝脏与血液的物质交换将明显障碍，血液中的药物（特别是生物大分子药物）难以作用于肝细胞。我们设想通过基因治疗的手段将外源hHGF 基因导入患者肝细胞，使得该基因在肝细胞内大量表达，从而自分泌hHGF 能与肝细胞表面受体c-met 结合，从而发挥最大的促肝细胞再生的作用。本研究从慢性乙型肝炎患者活检的肝组织中提取总RNA，按照GenBank 中检索出的hHGF 基因cDNA 序列， 进行BLAST 同

19、源性检索分析后，设计hHGF 编码区全长基因的上、下游引物，进行RT-PCR 扩增，获得长度为2187bp 的TIMP-1 编码区全长cDNA。由于将PCR 产物直接酶切，与pcDNA3.0 表达载体相连的连接效率将很低下。因此，我们先将加“A”的PCR 产物与T 载体构建中间重组体pMD-18 连接，以便最终将hHGF 正向克隆至pcDNA3.0 真核表达载体上。目前，应用于基因治疗的基因转移系统主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。其中，病毒载体系统在体内外实验中使用较多，但是其缺点在于具有自身免疫原性、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差以及潜在的致癌性等。故人们越来越重视非病毒载体的研

20、究。常用的非病毒载体包括裸质粒DNA、脂质体载体以及阳离子多聚物载体等。但在使用非病毒载体进行体内基因治疗时， 普遍存在转染效率低的问题7。本研究所使用的水高压注射方法可以明显提高非病毒载体的体内转染效率，使质粒DNA 在肝脏获得高效表达。水高压注射，即将大体积的裸质粒DNA 溶液经小鼠或大鼠尾静脉快速注入，大量的质粒溶液导致循环血量的急剧增加，超过心脏负荷，血液积聚在肝血窦中不能回流，延长了质粒DNA在肝窦中的停留时间，从而被肝组织细胞摄取8耀10。我们前期研究表明，经小鼠尾静脉单次水高压注射后，目的基因的表达局限于肝脏系统以内，且转染效率高，72 小时内出现表达高峰，表达持续时间可维持一周

21、左右11。然而，关于该方法的详细机理目前尚不清楚。本研究首次建立连续水高压注射的方法，继第一次水高压注射100 mg 裸质粒pCMV-hHGF 后，每3 天以同样的方法重复注射一次，总共7 次，水高压注射后实验动物无明显异常反应。于首次水高压注射后第0、3、6、9、12、15、18 和21 天分别检测小鼠外周血和肝脏hHGF 的表达，结果发现无论外周血还是肝脏中hHGF 的表达始终能保持在一个较高的水平。理论上该方法可以无限制重复。因此可通过该方法实现保持目的基因在小鼠肝脏的长时间高水平表达。重复水高压注射法操作简单，费用低，无明显副作用，普遍适用于肝脏病基因治疗的动物研究。参考文献1 KOE

22、NIG M，KLOTZ E，LUKA B，et al. Perfusion CT of thebrain:diagnostic approach for early detection of ischemicstrokeJ. Radiology，1999，209（1）：85-93.2 HUNTER GJ，KRAUZ M，THEEK C，et al. Assessment ofcerebral perfusion and arterial anatomy in hyperacutestroke with three -dimentional functional CT:early clinica

23、lresultsJ. A JNR，1998，19：29-37.3 ROTHER J，FIALA A，JONETZ L，et al. Hemodynamic assessment of acute stroke using dynamic single -slice CTperfusion imagingJ. Arch Neurol，2000，57（8）：1161-1166.4 NAKAMURA T，NISHIZAVA T，HAGIYA M，et al. Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factorJ. Nature，1989，342（6248）：440-443.5 STOKER M，GHERARDI E，PERRYMAN M，et al. Scatterfactor is a fibrobla