黄芩茎叶总黄酮对原代培养大鼠肝细胞损伤的保护作用

1、黄芩茎叶总黄酮对原代培养大鼠肝细胞损伤的保护作用<                作者：李素婷，杨鹤梅，周晓慧 【关键词】  黄芩茎叶总黄酮；,肝细胞；,原代培养；,保护作用；,机制摘要：目的 研究 黄芩茎叶总黄酮（SSTF）对原代培养大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用及其机理。 方法 采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养，用H2O2和CCl4体外诱导肝细胞损伤，同时加以不同浓度的SSTF对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移

2、酶（ALT）活性、肝细胞内丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性，MTT法测定肝细胞增殖活性。结果与模型组比较，SSTF明显抑制H2O2和CCl4引起的肝细胞培养液中ALT活性的升高，肝细胞存活率明显升高，还可明显恢复H2O2引起的肝细胞MDA含量的升高和GSHpx 活性的降低明显。结论 SSTF对培养大鼠肝细胞损伤有明显的保护作用，其机制可能与其抗脂质氧化作用有关。关键词：黄芩茎叶总黄酮；  肝细胞；  原代培养；  保护作用；  机制Study on the Protective Effect and Possible Mecha

3、nism of Scutellaria baicalensis Stem-leaf Total Flavonoid on Primary Cultured Rat  Hepatocytes Injured by H2O2 or CCl4 Abstract：ObjectiveTo study the protective effect and possible mechanism of Scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid(SSTF) on primary rat  hepatocyes  injured

4、 by H2O2 or CCl4.MethodsPrimary  hepatocytes were isolated,cultured  by trypsin digestion and induced by H2O2 or CCl4.Various  concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes . The contents of malondialdehyde(MDA) and activity of glutathion peroxidase(GSH-px) in

5、hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods,the viabilities of hepatocytes were measured by MTT. ResultsCompared with model group, SSTF could restore remarkably ALT level in supermatant of cultural hepatocytes, decrease MDA  content  and e

6、levate GSHpx activity of  hepatocytes ,hepatocyte viabilities increased significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary rat  hepatocyes  injured by H2O2 or CCl4. These might be associated with its antilipoperoxidation function.Key words：SSTF;   Hepato

7、cytes ;   Primary cultured ;   Protective effect;   Mechanism.     黄芩茎叶总黄酮（Scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid ，SSTF）是承德 医学 院中药研究所从唇型科植物黄芩的茎叶部分提取的有效成分，整体实验已证实SSTF具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化及保肝等作用14。为进一步研究SSTF保肝作用及其机制，本文采用胰蛋白酶消化法分离肝实质细胞进行体外培养，用CCl4

8、和 H2O2体外诱导肝细胞氧化损伤模型，在细胞水平上证实SSTF对肝细胞损伤的保护作用及其机制，为进一步阐明SSTF的药理作用及中药新药的研发和 应用 提供可靠依据。1   材料与方法1.1  药品与试剂  SSTF（含总黄酮73%）：承德医学院中药研究所提供，临用前以蒸馏水配制，用饱和碳酸氢钠调pH=7.6；Hanks液高压灭菌，4保存；0.80 gL-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH7.2，分装,-30保存；1%PVP：北京华美公司提供；基础培养液：RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调p

9、H至7.2，定溶到1000 ml，过滤除菌，临用前每80ml，加入新生小牛血清20ml，青霉素100 gml-1，链霉素100 gml-1，胰岛素5 gml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-Px测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。1.2  动物23 d龄SD大鼠乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物 管理 中心提供。1.3  仪器 CO2培养箱（Taibai LNA122D 日本），MD100半自动生化 分析 仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。1.4  肝细胞分离培养5取

10、新生SD大鼠10只，75%酒精中浸洗后断头处死，无菌分离肝脏，迅速置Hanks液中，用Hanks冲洗数次除去血污，剥除被膜和纤维成分，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的 组织 块，加入0.80 gL-1胰蛋白酶和1%PVP，37消化58 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗3次，1800 r/min离心5 min，收集肝细胞并计数，按1 ×109个L-1，接种于铺有多聚赖氨酸的24孔和96孔板中，37，5%CO2条件下培养，4 h首次换液去除血细胞，以后每24 h换液1次。1.5  

11、SSTF对H2O2诱导肝细胞损伤的 影响 取上述原代培养48 h肝细胞，设H2O2损伤模型组、SSTF(50 mgL-1，100 mgL-1，200 mgL-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和保护组加入H2O2 0.5 mmolL-1，同时保护组加入不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养4h，收集24孔板中培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞测定MDA含量和GSH-PX活性，MTT比色法测定96孔板中肝细胞的存活率。1.6   SSTF对CCl4 诱导肝细胞损伤的影响设CCl4损伤模型组、SSTF(50 ，100 ，200 mgL-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。肝细胞培养24h后换液，模型组和SSTF组加入CCl4(二甲基亚枫配制)，终浓度为10 mmolL-1，同时SSTF组加入不同浓度的