心脏缺血再灌注损伤后一氧化氮合酶的变化(一)

1、心脏缺血再灌注损伤后一氧化氮合酶的变化(一)作者：唐省三,马亚珍,刘红云,朱晓琴,雷水生【关键词】 再灌注损伤Changes of nitric oxide synthesis in cardiac ischemia reperfusion injury【Abstract】 AIM: To investigate the expression and function of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) during ischemiareperfusion injury (IRI) in ra

2、t hearts. METHODS: IRI was induced by clamping the left anterior descending (LAD) of coronary artery for 1h, followed by reperfusion. Nitric oxide synthase (NOS) activities of hearts was assayed at various time points and NOS protein levels as well as NOS mRNA expression were determined by Western b

3、lot and RTPCR methods respectively. RESULTS: eNOS activity, protein level and mRNA expression all increased after 26 h of IRI and decreased after 3 d of IRI and then gradually returned to basal level after 21 d. iNOS was expressed after 12 h of IRI and reached the peak level at day 3 after IRI and t

4、hen decreased to basal level. CONCLUSION: The expression of iNOS is high while that of eNOS is low during cardiac ischemiareperfusion injury. Proper regulation of eNOS and iNOS expression may be therapeutically helpful in treating patients with cardiac ischemiareperfusion injury.【Keywords】reperfusio

5、n injury; nitric oxide synthase; heart【摘要】 目的： 研究大鼠心脏缺血再灌注损伤(IRI)过程中一氧化氮合酶(NOS) 的变化规律及其作用. 方法： 制作SD大鼠心脏IRI动物模型,用同位素法测定正常及IRI心组织的NOS活性；用Western印迹和逆转录PCR法分析eNOS和iNOS 在IRI过程中蛋白和基因表达的变化.结果： 心脏eNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注26 h后均增高，3天后降低，21天后逐渐恢复到正常水平. 心脏iNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注12 h后开始表达，3天达高峰，然后逐渐降至正常水平. 结论

6、： 单纯缺血并不引起NOS 活性的明显变化,再灌注损伤使NOS的mRNA表达增加,酶的合成增多,活性增高.【关键词】再灌注损伤；一氧化氮合酶；心脏0引言一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起着极其重要的作用1.一氧化氮合酶(nitric oxide synthesis, NOS) 可分为原生型(cNOS) 和诱生型(iNOS) .cNOS 依存在的部位分为神经型(nNOS) 和内皮型(eNOS).心脏组织内的NOS同功酶有两种,即eNOS和iNOS. 参与炎性反应及急性排斥反应等病理过程2. 我们研究eNOS和iNOS在心脏IRI中的变化规律及其作用,为其防治提供理论基础

7、.1材料和方法1.1材料SD大鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；iNOS Assay Kit 购自南京建成生物技术研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOS mAb 购自武汉博士德公司； HRP标记的兔抗羊IgG二抗购自Sigma 公司； Trizol裂解液、Oligo(dT) 、TaqDNA聚合酶和逆转录酶(AMV RT)均为美国Gibco 公司产品；eNOS和iNOS 引物及内参照由上海博亚生物技术公司合成. 冠状动脉阻断再灌注模型制备3后在不同的再灌注时间点处死大鼠,收集心脏标本,液氮急冻, -70保存备用.1.2方法取雄性200220 g SD大鼠120只,随机分为缺血再灌注（IR

8、I）组和假手术（对照,Control）组，每组60只，在再灌注不同时间点（0, 0.5, 1, 2, 6, 12 h和1, 3, 7, 14, 21, 30 d ）处死大鼠，每组每个时间点各5只.1.2.1NOS活性的测定IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2 g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2 g,采用iNOS Assay Kit进行测定. 心组织NOS活性的测定采用3H精氨酸同位素法4 , 心组织在4含有1 mmol/L leupeptin, 2 mmol/L aprotonin, 1 mmol/Lphenylemthylsulfonyl fluoride, 1 mmol/L DTT, 1

9、ml/L Triton X100的30 mmol/L HEPES缓冲液中匀浆,反应液为30 mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4),含1 mmol/L CaCl2, 100 mmol/L NADPH, 300 mmol/L tetrahydrobiopterin, 1 mmol/L dithiothreitol,以40 mmol/L L3H精氨酸(37 kBq/反应液)为反应底物,在37下反应30 min,用200 L 含100 mmol/L EGTA的终止液终止反应,反应体系过5 cm的Dowex离子交换层析柱,加闪烁液后读取放射性记数. 蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每

10、克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.1.2.2Western印记检测iNOS和eNOS蛋白表达IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2 g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2 g,以51(V/m)比例置匀浆缓冲液（含50 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 5 g/L cholate sodium, 1 g/L SDS, 2 mmol/L EDTA, 10 g/L Triton X100,100 mL/L甘油，1 mmol/L PMSF, 2 mg/L aprotinin）匀浆破碎组织. 匀浆液于4 10 000 g离心15 min，收集上清液并用dyebin

11、ding (BioRad)方法以牛血清清蛋白为标准测定蛋白浓度. 取含30 mg总蛋白的各组标本匀浆上清液点样进行75 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离Mr 135 000的iNOS及150 000的eNOS蛋白. Mr标准采用预染的彩虹重组蛋白(Amersham International plc, Buckinghamshire, England). 电泳后的凝胶通过Western印记装置（BioRad）电转移蛋白质至hybond C膜(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England).转移膜经封闭、与1500稀释的iNOS或e

12、NOS mAb 4孵育过夜、洗涤、与15000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG室温孵育1 h和第2次洗涤，最后用ECL Western印记荧光检测系统(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) 显色、曝光于X光底片(Fuji, Tokyo, Japan)和显影、定影.将感光X 光片上蛋白条带应用HPIAS 2000 型图像分析系统(同济千屏影像工程公司生产) 扫描测定光密度(OD) 定量.1.2.3RT PCR检测iNOS和eNOS的转录IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2 g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2 g,采用Trizol试剂提取总RN

13、A，以thermoscriptTM RTPCR系统进行逆转录和PCR反应. PCR反应采取等量逆转录cDNA模板，分别以iNOS, eNOS, actin特异性引物进行PCR反应. 扩增iNOS的引物对为： sense： 5TGGCTTGCCCTTGGAAGTTTCTC3, antisense: 5TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA3，预计扩增产物为574 bp iNOS cDNA片段，PCR反应条件为95 5 min；95 30 s，60 45 s，72 1 min，共30个循环；72 10 min. 扩增eNOS的引物对为： sense: 5TACGGAGCAGCAAATCCA

14、C3, antisense: 5CAGGCTGCAGTCCTTTGATC3，预计扩增产物812 bp，PCR反应条件为95 5 min；95 45 s，60 45 s，72 1.25 min，共30个循环；72 10 min. 内对照actin的扩增引物对为： sense: 5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3, antisense: 5CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3，预计产物为540 bp， PCR反应条件为95 2 min； 95 30 s， 60 45 s， 72 1 min，共30个循环；72 10 min. PCR产物以含0.5 mg/L溴乙锭的10 g/

15、L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光照下观察电泳条带,用BioRad凝胶分析系统分析结果，结果以光密度值（OD）表示.统计学处理:数据均以xs表示. 应用SPSS11.0软件进行方差分析, P0.05为有显著性差异.2结果2.1心脏IRI时NOS活性的变化单纯缺血1 h，心脏NOS活性与对照组相比无明显变化.心脏恢复血供再灌注0.5 h后cNOS活性即开始升高, 以26 h最高, 与对照组相比,差异有显著性意义(P0.01) ；但12 h后却迅速下降,3 d时活性最低与对照组相比,差异有显著性意义(P0.01),以后逐日恢复,21 d时心恢复正常. iNOS活性在对照组心脏表达微弱,再灌注2 h 后逐

16、渐升高, 12 h3 d活性达高峰, 与对照组相比差异有显著性意义(P0.01),以后逐渐下降,7 d 后基本恢复正常(Tab 1) .表1心脏IRI后cNOS和iNOS的活性变化（略）2.2Western印迹IRI组再灌注0.5 h后心脏eNOS蛋白质表达即开始升高,2 h达到高峰,12 h后开始减少,3 d时为最低,以后逐渐恢复,21 d时恢复至对照组水平,与NOS活性变化相一致.对照组心脏检测出iNOS蛋白微量表达,但表达量远低于eNOS, IRI可诱导其表达,在12 h后表达逐渐增强,3 d时表达最强,随后逐渐减弱,21 d时恢复对照组水平,也与iNOS的活性变化相一致(Fig 1,

17、Tab 2).表2Western印迹法测定心脏IRI 后eNOS 和iNOS 蛋白表达(略)2.3NOS mRNA的基因表达IRI组心脏再灌注早期(0.512 h) 即可诱导eNOS mRNA表达增强,2 h达高峰,此后随着损伤程度加重,其表达迅速下降. 3 d低于对照组,以后逐步恢复,21 d已相当对照组水平. 在对照组心脏iNOS mRNA表达微弱,再灌注12 h后开始增强,3 d达高峰,21 d恢复正常水平(Fig 2, Tab 3) .以上eNOS和iNOS mRNA的消长变化与蛋白质的表达和酶活力的变化一致.表3大鼠心脏IRI后eNOS和iNOS mRNA半定量结果(略)3讨论eNO

18、S来源的NO具有舒张心血管,抑制白细胞浸润和血小板的凝聚作用5，从而对心脏可能起到保护作用. Song等6的研究表明,在早期eNOS的过量表达对小鼠骨骼肌的IRI具有保护作用,随着损伤过程的进展, 心脏结构和功能的损害不断加重,eNOS表达也相应迅速下降.这可能由于大量心肌细胞坏死和凋亡,导致eNOS的合成减少有关. eNOS的表达随着心脏损伤修复和心功能的恢复逐步恢复. NO在心肌再灌注损伤中加重心肌损害. 缺血再灌注情况下,多种细胞因子上调巨噬细胞等内的iNOS的mRNA表达,立即产生大量的iNOS和NO. 过量的NO与氧迅速反应生成大量的氧自由基如过氧亚硝酸阴离子(ONOO),后者可进一

19、步反应生成HO-, NO2, NO3-等,其结果是引起和加重心肌缺血再灌注损伤7.我们发现，单纯缺血1 h对心脏NOS活性无明显影响,再灌注30 min 后NOS活性即开始升高,26 h到达高峰,持续到6 h，此后迅速下降,24 h降低到正常以下,21 d时恢复至正常水平. RTPCR分析发现eNOS及iNOS mRNA的变化与其蛋白变化相一致. 可见在IRI中,早期eNOS的高表达可能参与了早期心血流的调节,对抑制心血管痉挛、减少炎性细胞的浸润有关；iNOS参与介导了心脏IRI的炎症损伤.可以设想,在器官保存过程中或移植后早期使用iNOS 的抑制剂,将会减少急性心肌坏死和凋亡以及急性排斥反应

20、的发生, 对IRI 起到保护作用,促进心功能的恢复，为临床提供科学的理论依据.【参考文献】1 张荣庆，徐凯，程何祥，等. 卡维地洛对缺氧心肌细胞NO生成的影响J. 第四军医大学学报，2002；23（22）：2071-2073.Zhang RQ, Xu K, Cheng HX, et al. Effects of carvedilol on nitric oxide production by myocardial cells during anoxia J. J Fourth Mil Med Univ, 2002；23（22）：2071-2073.2 许春梅，董卫国，余保平，等. 低氧诱导因子

21、1及诱导型一氧化氮合酶在炎症性肠病中的表达J. 第四军医大学学报，2004；25（17）：1558-1561.Xu CM, Dong WG, Yu BP, et al. Expression of hypoxiainducible factor 1 alpha(HIF1) and inducible nitric oxide synthase(iNOS) genes in inflammatory bowel disease J. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（17）：1558-1561.3 Suzuki M, Sasaki N, Miki T, et al. Role of sarcolemmal K(ATP) channels in cardioprotection against ischemia/reperfusion injury in mice J. J Clin